为什么甘油能让菌种“冻而不死”？—菌种保存！
发布时间：2025-06-06 浏览次数：15
甘油在微生物菌种保存（特别是冷冻保存）中能有效保护菌种，主要基于以下几个关键原理：
1、降低冰点与抑制冰晶形成（冷冻保护）：
纯水在0℃结冰，形成的尖锐冰晶会像刀子一样刺穿微生物的细胞膜、细胞壁和内部结构（如细胞器、DNA），导致细胞死亡。
甘油是一种多羟基醇，溶于水后能与水分子通过氢键强烈结合。这干扰了水分子形成规则冰晶网络的能力。
降低冰点： 甘油溶液比纯水在更低的温度才会开始结冰。
减小冰晶尺寸，抑制冰晶生长： 在冷冻过程中（无论是慢速冷冻还是快速冷冻），甘油的存在显著减小了形成的冰晶尺寸，并使冰晶的结构变得更圆滑、更小、更少。这大大降低了尖锐冰晶对细胞造成的物理损伤（机械损伤）。
促进玻璃化（Vitrification）： 在极低温度下（如-80℃或液氮温度-196℃），高浓度的甘油溶液倾向于形成一种玻璃态或非晶态固体，而非尖锐的晶体结构。这种玻璃态就像极其粘稠的糖浆冻住了，没有明显的晶体边界，从而最大限度地消除了冰晶损伤。
2、渗透压缓冲（渗透保护）：
在冷冻过程中，细胞外的水分会首先冻结，导致细胞外溶液的溶质浓度急剧升高（溶液变浓），形成极高的渗透压。
如果没有保护剂，细胞内水分会因渗透压差被大量抽出（细胞脱水），导致细胞严重皱缩甚至死亡。复温时，外部冰融化导致渗透压骤降，水分又会快速涌入细胞，可能导致细胞膜破裂（渗透性休克）。
甘油是可渗透性保护剂（Cryoprotectant Permeant - CPA），这意味着它能够缓慢地穿过大多数微生物的细胞膜进入细胞内部。
平衡渗透压： 当甘油进入细胞后，它在细胞内外都提高了溶液的浓度（降低了水活度）。在冷冻过程中，它有助于平衡细胞内外环境的渗透压，显著减少了细胞脱水的程度和速度。这使得细胞在冷冻/解冻过程中体积变化更缓和，减轻了渗透压变化带来的压力。
3、稳定生物大分子与细胞膜：
氢键作用与水合作用： 甘油分子上的羟基可以与蛋白质、核酸、磷脂等生物大分子上的基团（如氨基、羧基、磷酸基）形成氢键。这种相互作用有助于在冷冻脱水期间或低温状态下，稳定这些大分子的三维结构，防止其变性、沉淀或聚集。
维持膜流动性： 甘油被认为可以插入细胞膜的脂质双分子层中，有助于在低温下维持细胞膜一定的流动性或防止其发生有害的相变（如从液晶态转变为凝胶态），从而保持膜结构的完整性。
4、降低水活度：
甘油本身具有吸湿性，其大量羟基结合水分子，降低了溶液中的“自由水”含量，即降低了水活度。较低的水活度本身就不利于许多生化反应和微生物活动（即使在未冻结状态下），这有助于在冷冻前和部分解冻状态下保持菌种的稳定性。
总结来说，甘油在微生物冷冻保存中的作用是多方面协同的：
物理保护： 抑制有害冰晶的形成和生长，减少冷冻/解冻过程中的机械损伤。
渗透保护： 作为渗透性保护剂，缓冲细胞内外渗透压的剧烈变化，减轻脱水损伤和渗透性休克。
生化保护： 通过氢键等作用稳定蛋白质、核酸和膜结构，防止低温变性和损伤。
降低水活度： 创造不利于微生物活动的微环境。
关键操作要点：
浓度： 通常使用 15-30% (v/v) 的终浓度（常见20%-25%）。浓度过低保护不足；浓度过高可能因渗透压过高或甘油本身的毒性导致细胞损伤。不同微生物对甘油的耐受性不同，需要优化。
纯度与无菌： 必须使用高纯度（如分析纯或细胞培养级）的无菌甘油。甘油通常通过高压蒸汽灭菌（121°C, 15-20分钟），注意甘油高温下易变黄但不影响保护效果，关键是灭菌彻底。也可用0.22μm滤膜过滤除菌。
制备： 通常与菌悬液（处于对数生长期，浓度较高）等体积混合，以达到最终所需的甘油浓度。确保甘油与菌液混合均匀。
冷冻速度： 通常推荐缓慢冷冻（如使用程序降温盒或置于-70℃至-80℃冰箱过夜后再转移至液氮），让甘油有足够时间渗透入细胞并发挥保护作用。对于某些耐受性强的微生物，直接投入液氮气相或-80℃冰箱也可行。
储存温度： -80℃冰箱或液氮（-196℃） 是最常用的长期保存温度。
避免反复冻融： 解冻后应尽快使用，避免多次冻融循环，每次冻融都会造成损伤累积。
与其他保护剂的比较：
DMSO（二甲基亚砜）： 也是常用的渗透性冷冻保护剂，保护机理类似甘油。渗透速度通常比甘油快，对某些微生物效果更好，但对某些细胞类型毒性更大或有特殊气味。
脱脂牛奶/海藻糖（冻干保护剂）： 主要用于冷冻干燥保存（冻干法）。它们是非渗透性保护剂，主要通过在细胞外层形成保护性基质、替代水分子稳定大分子结构等方式保护细胞。
甘油的优势： 相对安全（低毒），价格低廉，操作简便，对大多数细菌、酵母、丝状真菌都有良好效果，因此在微生物实验室冷冻保存中应用最为广泛。
总而言之，甘油通过其独特的物理化学性质（多羟基、渗透性、与水分子强相互作用），在微生物冷冻保存中起到了多重保护作用，有效防止了冰晶损伤、渗透压损伤和低温变性，使得微生物能够在超低温下长期存活。
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