中国工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

一、基因敲除Knock out

1）原理：是用含有一定已知序列的小DNA片段与受体细胞gene组中序列相同或相近的gene发生同源重组，整合至受体细胞gene组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

2）载体：
      ① CRISPR/Cas9载体：通过Cas9核酸酶和sgRNA靶xiang序列精que定位并靶向基因DNA序列,然后引入双链断裂点，完成gene敲除。
      ② TALENs载体：包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。
      ③ ZFNs载体：包含具有特异性的锌指结构域和核酸酶，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。

3）载体构建方法

① 设计和选择：设计gene敲除的靶点，选择CRISPR/Cas9等工具进行编辑。
② 载体插入：将编辑过的靶点序列插入到特定的载体中。
③ 转化和验证：转化编辑好的敲除载体至大肠杆菌中，进行筛选鉴定，验证敲除效果。
④ 导入目标细胞：通过病毒载体、电穿孔等方法将敲除载体导入到目标细胞中。

二、基因敲低

1）原理：gene敲低又称gene敲降，是利用抑制剂来抑制gene的表达过程。有几种不同的抑制方式可用于抑制gene的表达，其中主要的抑制方式有RNA干扰技术(RNAi)，CRISPR-Gas9技术以及gene转染技术。这些技术使用不同的原理，但它们的共同点是都能够发挥gene敲低的效果。

2）载体：
      ① siRNA载体：短干扰RNA。在3'端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列，特异性地实现靶向mRNA降解。
      ② shRNA载体：短发夹RNA。一种siRNA前体，包括一个“茎”和一个“环”结构，由RNA序列的短区域(这些区域形成“茎”)之间的碱基配对形成,由不形成碱基对的短序列(形成“环”)隔开。
      ③ CRISPRi载体：包含CRISPRi靶向序列和转录抑制子，通过抑制靶向gene的转录水平实现gene敲低效果。

3）载体构建方法

① 设计干扰序列：采用在线设计工具或经验公式来计算。
② 合成和克隆：合成干扰序列的DNA或RNA小片段，并克隆到转录载体中，生成siRNA或shRNA表达载体。
③ 转化和筛选：将siRNA或shRNA表达载体转化至大肠杆菌中，进行筛选鉴定。
④ 导入目标细胞：通过病毒等途径将重组质粒导入目标细胞中。

三、基因敲入

1）原理：利用gene同源重组，将外源的功能gene(gene组原先不存在、或已失活的gene)转入细胞与gene组中的同源序列进行同源重组，插入到gene组中，在细胞内获得表达的技术。

2）载体：
① sgRNA-Cas9载体：在KI基因编辑系统中像一把“剪刀”，可以精准切开双链DNA，这把“剪刀”锋利与否和精确度能直接影响Kl基因编辑系统的编辑效率。
② Donor DNA：一段高度同源的DNA模板。以Donor DNA为模板进行修复，可以将目的片段定点引入gene组。

3）载体构建方法

① 设计sgRNA及修复DNA模版：为了保证sgRNA没有预ce的脱靶结合位点，根据人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计sgRNA，并进行软件分析。设计DNA修复模版，其两侧各有600bp的同源臂。
② 构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒：选定sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因，将其克隆到pCas-Guide中来制备pCas-Guide-AAVS1；再将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体。
③ 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞：用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。

本文由环凯转载自“Dr实验助手”公众号，版权归原作者（实验铁）所有，仅供学习参考，如有侵权请联系删除！