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在细胞培养的科研探索之路上，“铺板为何总不均匀？”“消化传代错用培养基该怎么办？”“缓冲液中酚红、钙镁离子对细胞培养影响几何？”

这些问题如同拦路虎，频频困扰着实验人员。这些正是从细胞培养答疑群中精选出的三大热点疑问，我们将深入剖析，为你揭开细胞培养难题的神秘面纱。

1、铺板不均匀

Q：铺板次日，细胞分布疏密不均，部分区域密度极高，而有的地方却稀疏得很，这究竟是怎么回事？
A：遇到细胞铺板后分布不均的状况，需要抽丝剥茧、分类分析。常见的不均匀类型主要有三种：随机分布不均、边缘多中间少、边缘少中间多。

先来看第一种 —— 随机分布的不均匀。这种情况的 “罪魁祸首”，大概率是铺板前细胞未能充分分散为单细胞悬液。一旦存在细胞团块被接种到孔内，经过一夜生长，这些区域自然就会呈现出细胞过密的现象。

想要规避此类问题，可以从以下三个关键环节进行优化：

1. 精准把控细胞消化：部分细胞对胰蛋白酶极为敏感，消化时极易成片脱落。针对这类细胞，应避免使用含 EDTA 的胰蛋白酶；也可通过稀释胰酶浓度，或者加入胰酶后迅速吸走大部分，仅留少量在瓶内消化，以此精准调控消化进程 。
2. 彻底吹散细胞：离心后的细胞重悬过程中，务必耐心细致地吹打，建议不少于 20 次。在细胞计数时，若发现仍有较多细胞团，必须继续吹打直至细胞充分分散。
3. 及时镜检筛选：完成铺板后，需即刻在显微镜下随机选取多个视野观察。一旦发现有细胞团，该孔细胞应果断舍弃，重新铺板；若多个孔均存在此问题，则需更换新板重新操作。

第二种情况是边缘多中间少，这种现象在孔面积较小的 96 孔板铺板后尤为常见。

当孔的面积特别小、例如96孔板这种，铺板后就常见细胞边缘多中间少的现象。究其原因，主要是孔内液面形成了边缘高、中间低的弯液面，导致表面张力分布不均。如下图所示：

图源：https://www.researchgate.net/figure/a-c-Solutions-of-the-three-dimensional-model-obtained-at-systematically-varied_fig3_350402772

此时，细胞在重力沉降的同时，还会受液体向孔边缘流动的拽力影响，逐渐聚集到边缘区域。

而造成这种结果的操作因素主要有两点：一是孔内液体体积不足，二是液体打出速度过快。

以 96 孔板为例，当孔内液体体积小于 100μL 时，弯液面现象显著；而增加到 200μL 时，细胞分布不均的情况会得到极大改善。

图源：https://www.bmglabtech.com/en/howto-notes/how-to-deal-with-path-length-and-meniscus-in-microplates/

此外，若使用移液器快速将细胞悬液全部冲击到孔内壁，会在局部形成高液面，加剧细胞边缘聚集；

相反，以 50μL / 秒的速度缓慢将液体沿孔壁注入，可促使孔底液面均匀铺展，有效降低弯液面的影响。

对于 24 孔板、6 孔板等较大孔板，虽然弯液面效应相对较弱，但同样要保证足够的液体体积，24 孔板建议加入 1mL 液体，6 孔板则需 3mL。

第三种边缘少中间多的情况，多发生在 6 孔板等培养面积较大的孔板上。

这主要是由于细胞悬液持续冲向孔底部与孔壁连接处的边缘，就像水管对着墙角喷水，水流会反向涌动，使得细胞向打出方向的反方向流动。

由于孔内面积较大，细胞无法直接到达另一端，最终大量聚集在中部区域。

改善方法与上述类似，可降低液体打出速度，让细胞悬液沿孔壁缓缓流入，并增加液体打出的位置，选择 2 - 3 个孔内壁位置分次注入全部液体。

以上就是细胞铺板不均匀的三种情况的对应原因分析和解决办法。不少同学还关心铺板后的混匀操作，即如何摇晃孔板？

在这方面，关键在于把握摇晃力度与静置时长。

对于 96 孔板，可在台面上轻柔地画 “十” 字或 “∞” 字，重复 2 - 3 轮；

而 24 孔板、6 孔板，因孔内液体多、开口面积大，大幅度晃动易导致液体洒出，建议一手扶住孔板一侧，另一手轻轻拍打对侧边缘 5 - 6 次。

无论何种规格的孔板，摇晃后都需静置台面至少 15 分钟。然后再轻轻拿起来、慢慢走到培养箱旁放下，打开培养箱的门后，轻轻拿起培养板、小心放入，再轻轻关上门。

因为我们要让细胞有足够的时间沉到孔底，所以静置的时间要足够，不用担心细胞在外面晾着会不会有问题，不会。我们拿起来孔板走动、放置这些动作都会造成液面波动，因此如果静置时间不够，细胞就会被液体流动带偏了。

2、用错培养基

Q：我的细胞一直用 DMEM培养基培养，消化后不慎使用 1640 培养基进行重悬和培养，这会对细胞有影响吗？
A：对于这种临时用错培养基的情况，需要依据发现时间来分类处理：若在几小时内察觉错误，还有补救机会；若 2 - 3 天后才发现，则需根据细胞类型和状态做进一步判断。

市面上常见的 1640、DMEM、F12 等商品培养基，都是在 MEM 基础培养基配方上改良而来，其差异主要体现在对不同细胞生长的适配性，而非细胞毒性或损伤。

图源：https://www.researchgate.net/figure/Composition-of-different-cell-culture-media-and-Krebs-Henseleit-buffer_tbl3_232224965

若在几小时内发现用错培养基，可将细胞悬液吸出，通过离心去除错误培养基，重新更换正确培养基即可。

若是 2 - 3 天后或次日才发现，此时贴壁细胞大概率已完成贴壁，你可以根据细胞的类型、状态来判断下一步操作。

原代细胞对培养基成分较为敏感，错用培养基可能导致细胞状态变差，出现生长停滞甚至少量死亡，遇到这种情况建议直接弃用；而细胞系通常耐受性较强，一般不会产生严重影响，无需消化细胞，直接更换为正确培养基即可。

3、钙镁/酚红

Q：在选择 HBSS 缓冲液时，面对含钙镁离子 / 不含钙镁离子、含酚红 / 不含酚红等不同规格，该如何抉择？
A：选择 HBSS 缓冲液的关键在于匹配实验需求，我们从离子成分和酚红添加两方面拆解分析。

一、Ca²⁺/Mg²⁺对实验的影响与选择

Ca²⁺和 Mg²⁺是细胞生理活动的 “幕后功臣”：Ca²⁺如同细胞与胶原、纤连蛋白等外基质间的 “黏合剂”，能显著提升细胞贴壁能力；Mg²⁺则作为 ATP 酶、DNA 聚合酶等核心酶的 “助手”，深度参与细胞代谢与信号传导。

若需消化细胞：建议优先使用不含钙镁离子的 HBSS。这是因为胰蛋白酶的活性会受钙镁离子浓度抑制 —— 想象胰酶是把 “剪刀”，而钙镁离子像无形的手束缚住它，导致剪碎细胞间连接的效率降低。此时用无钙镁 HBSS 洗涤，能为消化 “扫清障碍”。
若细胞贴壁不佳：可尝试用含钙镁离子的 HBSS洗涤细胞。通过补充关键离子，增强细胞与基质的黏附力，就像给细胞贴上更牢固的 “双面胶”，改善贴壁状态。

二、酚红的作用与使用场景

酚红是细胞培养中的 “pH 侦察兵”：当环境 pH 为 7.4 时，它呈现标志性红色；pH 下降（如细菌污染导致代谢酸积累），溶液迅速变黄；pH 上升则转为紫色。这一特性使其成为判断细胞状态的 “可视化工具”。

图源：https://www.researchgate.net/figure/Monitoring-pH-changes-in-cell-culture-by-phenol-red-Phenol-red-Phenolsulfonphthalein_fig1_368733721

如果细胞受到细菌污染，培养基就会很快变黄，其主要原因就是培养环境的pH下降得很多，造成酚红变色了。因此，培养基的酚红可以辅助我们判断一些细胞状态。

荧光或流式实验：必须选用不含酚红的 HBSS。酚红的自发荧光如同 “干扰信号”，会掩盖实验观察的真实荧光信号或影响流式细胞术的检测精度。实验前需用无酚红缓冲液彻底洗涤细胞，确保结果不受干扰。

最后再补充一个知识点，就是胰蛋白酶是否含EDTA对细胞消化有什么影响呢？

EDTA通过结合Ca²⁺/Mg²⁺，破坏细胞间连接（如钙黏蛋白依赖的细胞连接），辅助胰酶消化，当面对一些难以消化的细胞时，可以尝试使用含EDTA的胰蛋白酶。

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