中国工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

食品安全一直是全球关注的焦点，尤其是对致病菌的快速、准确检测至关重要。近年来，李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为一种重要的食源性病原菌，因其引发的严重感染性疾病而备受关注。传统的检测方法通常耗时长且需要复杂的设备和专业操作人员，这使得在现场快速检测变得困难。本文将介绍一种结合环介导等温扩增（LAMP）技术和超嗜热菌Argonaute（PfAgo）系统的新型检测平台，该平台能够实现对李斯特菌的超灵敏、高特异性检测，为食品安全检测提供了一种便携、快速、准确的解决方案。

李斯特菌的危害及检测需求

李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于各种食品中，尤其是即食食品和冷藏食品。它对免疫力低下的人群，如孕妇、老人和儿童，具有较高的感染风险，临床表现包括脑膜炎、败血症和流产等，具有高发病率和高死亡率。由于李斯特菌在酸性介质、高盐浓度和低温环境下具有强大的生存和繁殖能力，因此在食品加工的各个环节都可能发生污染，增加了食品安全风险。因此，亟需一种快速、准确的现场检测方法，以便及时采取控制措施，确保食品安全。

LAMP-PfAgo检测平台的原理

LAMP技术是一种新兴的等温扩增方法，具有时间短、灵敏度高的优点。然而，LAMP技术在特异性和假阳性问题上仍存在一定的挑战。为了解决这些问题，研究人员引入了PfAgo系统。PfAgo是一种源自超嗜热菌的核酸内切酶，能够识别特定的目标序列并产生强烈的检测信号。与CRISPR/Cas系统相比，PfAgo系统不受特定目标序列的限制，具有更广泛的目标序列选择范围，并且能够识别单个碱基的错配，从而提高了检测的准确性。

LAMP-PfAgo检测平台的开发

研究人员将LAMP技术与PfAgo系统结合，开发了一种新型的李斯特菌分子检测系统。该系统包括荧光检测和侧流条检测两种方法，能够在现场实现快速、特异、灵敏和便携的诊断。通过引入低成本的金属浴作为简单的扩增设备，该方法能够在较短时间内检测李斯特菌样本，展示了其作为便携、快速、准确和可视化核酸检测方法的潜力。

图1 基于LAMP-PfAgo的单核增生乳杆菌检测工作流程(A) LAMP-PfAgo法检测单核增生乳杆菌核酸可视化的具体过程。(B) gDNA引导下PfAgo“双步”裂解示意图。(C)基因组提取或快速样品裂解后进行分析所需的最小设备包括可移动电源、加热块、移液器和吸管。

实验结果与分析

检测灵敏度与特异性

研究结果表明，LAMP-PfAgo系统能够检测到低至1.8×10¹拷贝的李斯特菌hly基因水平，检测灵敏度高于传统的实时荧光定量PCR（qPCR）方法。

图2. LAMP-PfAgo检测单核细胞增生李斯特菌的特异性。(A)用于验证LAMP-PfAgo荧光检测特异性的终点荧光强度读数。(B)在紫外光和蓝光下肉眼观察LAMP-PfAgo荧光检测的特异性。(C)肉眼观察以验证LAMP-PfAgo-LFS检测的特异性。NTC：无核糖核酸酶的双蒸水（ddH2O）阴性对照。误差线表示平均值±标准误；n=3, ****表示P < 0.0001。

此外，该方法在检测18个食品来源样本时，表现出与qPCR相当的性能，且无其他病原体的交叉反应，显示出良好的特异性。

图3 LAMP-PfAgo检测单核细胞增生李斯特菌的灵敏度。(A) LAMP-PfAgo灵敏度的终点荧光强度读数；(B)在紫外光和蓝光下肉眼观察LAMP-PfAgo荧光检测的灵敏度。(C)肉眼观察LAMP-PfAgo-LFS检测的灵敏度。NTC：无核糖核酸酶的双蒸水（）阴性对照。误差线表示平均值±标准误；n=3, ****表示P < 0.0001。

现场检测的可行性

为了验证LAMP-PfAgo系统在现场检测中的可行性，研究人员对收集的牛肉、鸡肉和牛奶样本进行了检测。结果显示，该系统能够准确检测出3个李斯特菌阳性样本，检测结果与qPCR方法一致，验证了其高灵敏度和高特异性。此外，该方法对设备要求低，能够实现现场即时检测，具有良好的临床应用前景。

图4 采用qPCR、LAMP-PfAgo荧光检测法和LAMP-PfAgo-LFS检测法对食品源样本进行验证。(A) LAMP-PfAgo荧光检测法的结果，包括显示标准化平均荧光值的荧光热图，以及在紫外光和蓝光下的观察结果。(B)样本的qPCR检测结果。(C)样本的LAMP-PfAgo-LFS检测结果。泳道1-18：样本编号。

结论：LAMP-PfAgo检测平台的开发为食品安全检测提供了一种革命性的方法。该平台结合了LAMP技术的高效扩增和PfAgo系统的高特异性，能够在短时间内实现对李斯特菌的超灵敏检测。与传统的检测方法相比，LAMP-PfAgo系统具有设备简单、操作便捷、检测快速和结果直观等优点，特别适用于现场检测和流行病学监测。未来，该平台有望在食品安全、医疗卫生和环境监测等领域得到广泛应用，为保障公共健康和食品安全提供有力支持。

未来展望前景

随着分子诊断技术的不断发展，LAMP-PfAgo检测平台展示了其在快速、便携和高效检测方面的巨大潜力。未来，研究人员可以进一步优化该平台的检测性能，扩大其应用范围，并结合其他新兴技术，如微流控芯片和智能手机应用，开发出更加智能化和自动化的检测设备。此外，加强对李斯特菌等食源性病原菌的早期监测和控制，将有助于减少食源性疾病的爆发，保障食品安全和公共健康。

总之，LAMP-PfAgo检测平台的问世，为食品安全检测带来了新的希望。通过不断的技术创新和应用推广，我们有理由相信，这一新型检测平台将在未来的食品安全保障中发挥重要作用，为构建更加安全、健康的食品供应链贡献力量。

参考文献：Yu Z, Shao Y, Dong Y, et al. LAMP combined with Pyrococcus furiosus Argonaute for the ultrasensitive and highly specific point-of-care test platform for Listeria monocytogenes detection[J]. LWT, 2024, 207: 116640

来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。