中国工程院食品安全院士团队

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研究背景

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是全球分布的人兽共患病原菌，可感染多种宿主，在家禽中引发高度传染性的禽霍乱，造成巨大经济损失。目前防控禽霍乱主要依赖疫苗，但现有疫苗存在明显缺陷：减毒活疫苗虽能提供交叉保护，却有毒力返强风险；灭活疫苗安全性较高，交叉保护效果却有限。

subunit疫苗因抗原纯度高、安全性好、交叉免疫原性强，成为近年研究热点。Pm的毒力因子（如荚膜、外膜蛋白、脂多糖等）兼具免疫原性，是subunit疫苗的理想候选抗原，其中外膜脂蛋白PlpE在Pm感染中助细菌黏附宿主组织，且在A型Pm菌株中保守性超90%，此前重组PlpE蛋白疫苗已显免疫保护潜力。不过，多价重组蛋白疫苗受蛋白分子量限制，而抗原表位筛选（借助噬菌体展示、生物信息学等技术）可解决此问题，多国已用生物信息学筛选致病菌优势抗原表位开发疫苗，故本研究通过生物信息学筛选PlpE优势抗原表位，构建含其多表位蛋白的氢氧化铝佐剂灭活疫苗，评估对鸡的免疫保护效果。

研究方法

先进行多杀性巴氏杆菌（Pm）的分离鉴定与特性分析：复苏实验室保存的Pm C48-1标准株及2022年从四川邛崃分离的Pm菌株，在5%兔血琼脂平板培养观察菌落形态，经革兰染色、显微镜观察及16S rRNA PCR鉴定；将Pm接种含5%小牛血清的TSB培养基，每2小时取样计数，绘制生长曲线；用45日龄鸡测定Pm的半数致死量（LD50），将鸡分5组，皮下注射不同浓度菌液，7天记录死亡率，用Karber法计算LD50。

再通过生物信息学预测PlpE抗原表位：依据Pm的PlpE CDS序列设计引物，PCR扩增目标基因并测序；用在线工具分析PlpE氨基酸序列的理化性质、信号肽、跨膜区、二级结构、亲疏水性、表面可及性、抗原性和柔韧性；用IEDB预测B细胞和T细胞表位，结合NetMHCIIPan-4.0和MixMHC2pred工具预测辅助性T细胞表位，筛选优势表位，确定PlpE基因76-492 bp（对应氨基酸26-164位）为表达片段。

接着构建重组质粒并表达纯化PlpE多表位蛋白：设计特异性引物，以Pm基因组DNA为模板扩增目标片段，与pCold-SUMO载体连接构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21；在含氨苄青霉素的LB培养基培养工程菌，IPTG诱导表达后，超声裂解菌体，用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，经SDS-PAGE和Western blot验证纯度与特异性，BCA法测蛋白浓度。

随后制备各类疫苗并检测安全性：制备氢氧化铝佐剂，将Pm菌液用甲醛灭活后，分别制备氢氧化铝佐剂灭活疫苗（Alum）、PlpE多表位蛋白疫苗（PlpE）、PlpE多表位蛋白联合氢氧化铝佐剂灭活疫苗（PlpE+Alum），同时选用商用G190E40减毒疫苗作对照；将疫苗接种含5%小牛血清的TSA培养基检测无菌性，对15日龄鸡皮下注射疫苗，观察7天评估安全性。

最后开展鸡免疫保护实验：将60只15日龄鸡分6组（每组10只），分别接种上述4种疫苗、PBS（阴性对照），15日龄和30日龄各免疫1次；45日龄时，除阴性对照外，其余组鸡皮下注射5×LD50的Pm菌液，7天记录存活率、临床症状，死后或实验结束时剖检评分，制作组织病理切片；分别在免疫后0、15、30天采血，用间接ELISA检测血清IgG水平。

研究结果

多杀性巴氏杆菌（Pm）特性分析显示，该菌在5%小牛血清TSA培养基上呈圆形、微凸、光滑的乳白色菌落（图1A），在血琼脂平板上为湿润黏稠的灰白色非溶血菌落（图1B），革兰染色呈红色球杆状（图1C）；16S rRNA PCR扩增出约1386 bp片段（图1D），与Pm VP161菌株同源性达98%；生长曲线显示4-8小时为对数生长期，10小时活菌数达峰值（图1E），45日龄鸡的LD50为12CFU（表1）。

PlpE抗原表位预测与蛋白表达纯化结果表明，PCR扩增出约1011 bp的PlpE全长基因（图2A），生物信息学分析发现其1-23位为信号肽（图2B），无跨膜区（图2C），二级结构以无规则卷曲为主（图2D）。

筛选出8个B细胞优势表位和11个T细胞优势表位（表2、3），以及5个辅助性T细胞表位（表4）；重组蛋白经SDS-PAGE检测，纯化后在约37kDa处出现特异性条带（图3B），Western blot验证该条带能与His标签抗体结合（图3C），蛋白浓度为0.53mg/mL。

疫苗安全性检测显示，所有疫苗接种TSA培养基均无菌生长；对15日龄鸡接种后，7天内无鸡死亡，无精神萎靡、厌食等症状，接种部位无化脓肿胀，剖检内脏无病变，表明疫苗安全可靠。

免疫保护实验结果显示，免疫程序如图4A所示，攻毒后Pm组3天内全死亡，PlpE+Alum组存活率80%，Alum组70%，G190E40和PlpE组均50%，对照组100%（图4B）。病理观察发现，Pm组肝脏有白色坏死灶、肺萎缩出血、脾肿大、肠道严重出血等（图5A），PlpE+Alum组各组织病变最轻，病理评分显著低于其他疫苗组（图5B）。组织切片显示，PlpE+Alum组肝细胞排列整齐、肺充血减轻、脾淋巴细胞减少不明显（图6）。血清IgG检测显示，免疫后各疫苗组抗体水平均高于对照组，PlpE+Alum组在免疫后15天和30天的IgG水平显著高于其他疫苗组（图7）。

结论与展望

本研究通过生物信息学筛选多杀性巴氏杆菌（Pm）PlpE蛋白的优势抗原表位，成功表达纯化PlpE多表位蛋白，并制备出PlpE多表位蛋白联合氢氧化铝佐剂的灭活疫苗，该疫苗在鸡免疫实验中展现出优异的免疫保护效果，存活率达80%，显著高于商用G190E40减毒疫苗（50%）和单纯氢氧化铝佐剂灭活疫苗（70%），且能有效减轻鸡感染Pm后的病理损伤，诱导产生更高水平的特异性IgG抗体，为禽霍乱的防控提供了新的有效疫苗候选方案。

当前，禽霍乱仍是困扰家禽业的重要疫病，现有疫苗因保护率低、安全性隐患等问题难以满足防控需求。本研究开发的PlpE多表位蛋白联合疫苗，既利用了灭活疫苗的安全性，又通过多表位蛋白增强了免疫原性，为subunit疫苗与传统灭活疫苗结合的研发思路提供了实践依据。不过，该疫苗保护率尚未达100%，可能与佐剂选择有关，未来可尝试选用油乳佐剂、CpG佐剂等其他类型佐剂，进一步提升免疫效果；同时，可考虑将PlpE多表位蛋白与Pm的其他毒力因子（如OmpA、OmpH）的优势表位结合，构建多表位融合疫苗，扩大保护谱。此外，还需在不同品种、不同日龄的鸡以及自然感染条件下进一步验证疫苗的有效性和稳定性，推动该疫苗早日实现产业化应用，为家禽业健康发展提供更有力的保障。

参考文献：XIANG X L, SUN Y, ZHANG H L, et al. Evaluation of immunoprotective effects of PlpE multi-epitope protein incorporated within the aluminum hydroxide-adjuvanted inactivated vaccine against Pasteurella multocida (Pm) infection in chickens [J]. Poultry Science, 2025, 104: 105426.

来源：微生物安全与健康网，作者~刘嘉艳。