中国工程院食品安全院士团队

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细菌孢子因其卓越的抗逆性而成为食品安全和公共卫生领域的重大挑战。这些微小的生命体能够在极端环境下存活数十年，对传统的消毒和灭菌方法表现出惊人的抵抗力。在食品工业中，蜡样芽孢杆菌孢子导致的食品腐败每年造成巨大的经济损失；在医疗领域，艰难梭菌孢子引发的医院感染需要昂贵的防控措施；而炭疽芽孢杆菌孢子更可能被用于生物恐怖活动，威胁公共安全。传统的孢子检测方法各存局限：培养法虽可靠但耗时长达12小时以上；免疫分析法需要专业人员和昂贵试剂；PCR技术虽然灵敏却面临孢子DNA提取困难的问题。近年来发展的纳米粒子检测方法虽然具有潜力，但需要针对不同菌种进行专门优化，开发周期较长。表面增强拉曼光谱技术作为一种新兴的快速检测手段，通过金属纳米结构的局域表面等离子体共振效应，能够将拉曼信号增强10⁴-10¹⁰倍，实现对单个分子的检测。该技术无需标记即可快速识别分子指纹，特别适合现场检测应用。在细菌孢子检测中，CaDPA作为孢子特有的生物标志物，其含量占孢子干重的15%，成为理想的检测靶标。

Figure 1  (a)三维微流控芯片整体结构；(b)芯片设计截面示意图；(c)制备芯片的光学显微图像；(d)基于该芯片的检测流程。

1. 高效的CaDPA提取与特异性识别机制：

本研究采用探针超声法对Bacillus thuringiensis孢子进行破碎处理，通过20kHz、130W的超声波处理器在80%振幅下作用15分钟，实现了约75%的CaDPA释放效率。如Figure 1D所示，该方法通过物理破碎方式有效打破孢子坚硬的外层结构，释放内部CaDPA到溶液中。通过激光镊子拉曼光谱验证显示，野生型孢子在1019 cm⁻¹处表现出明显的CaDPA特征峰，而CaDPA缺陷型突变株则完全缺失该峰，证明了检测方法的特异性。高效液相色谱分析进一步确认超声处理后上清液中CaDPA浓度达到2.5mM，相当于成功从3×10⁹个孢子中释放出目标分子。

Figure 1  (A) 基于透射电镜的示意图展示了完整孢子的结构，其关键层被标注，包括富含CaDPA的核心区域。核心部位可见CaDPA化学结构示意图。(B)和(C)为扫描电镜图像，分别展示了野生型(WT)苏云金芽孢杆菌孢子和CaDPA缺陷型突变孢子的俯视图。各图中的EDS插图标明了选定区域碳和钙元素的分布。(D) 展示了从孢子中释放CaDPA的方法流程图，以及进行SERS检测前的后续样品制备步骤。(E) 苏云金芽孢杆菌孢子的LTRS光谱（黑线）、破碎孢子上清液（红线，插图中信号放大×5倍）及CaDPA缺陷突变孢子（绿线）的光谱对比。每条光谱均为30次独立测量的平均值。(F) 干燥上清液的扫描电镜图像，附有碳钙元素的EDS插图标示。

2. 金纳米棒的优化选择与增强性能验证：

研究团队系统比较了四种不同形状的金纳米颗粒（纳米棒、纳米球、纳米立方体和纳米双锥体）的光学性能。如图Figure 2A所示，吸收光谱分析表明只有纳米棒和纳米双锥体在785nm激光波长处有显著吸收，其中纳米棒的纵向等离子体共振峰与实验所用激光波长完美匹配。密度泛函理论计算揭示了DPA分子与金纳米结构之间的结合机制。如图Figure 2B所示，最优结合构型发生在金结构与DPA分子中心吡啶环氮原子之间，结合能达81kJ/mol，属于偶极吸引作用而非共价键合。这种结合方式与CaDPA中钙离子的配位几何相似，有利于保持分子的拉曼指纹特征。

Figure 2  (A) 使用CTAB作为表面活性剂分散在去离子水中的纳米棒、纳米球、纳米立方体和纳米双锥体的吸收光谱。纳米棒的最大吸收峰位于785 nm，这与SERS测量中使用的二极管激光波长相匹配。CTAB在785 nm处无显著吸收。(B) DFT计算优化几何结构的俯视图与侧视图，显示了DPA分子与金结构之间结合能最高的构型。可视化中，白色、灰蓝色、红色、黄色球体分别代表氢、碳、氮、氧、金原子。金结构定位于DPA分子中心吡啶基团的氮原子附近，该位点处于羧酸基团之间。

3. 超灵敏检测性能的系统验证:

通过稀释系列实验，研究人员证明了该方法在10³ spores/mL浓度下仍能清晰检测到CaDPA特征信号。如Figure 3A-C所示，即使在1000倍稀释条件下（相当于原始孢子浓度为10⁶ spores/mL），1017 cm⁻¹处的特征峰仍然明显可辨。统计分析显示，在0.1μL检测液滴中，10³ spores/mL浓度下有19%的测量数据超过空白限，而当使用1μL液滴时，这一比例提升至33%。值得注意的是，每个0.1μL液滴在10³ spores/mL浓度下仅含有相当于单个孢子10%的CaDPA量，表明该方法实际达到了亚孢子水平的检测灵敏度。

Figure 3  (A) 孢子上清液稀释系列（1:10至1:1000）的SERS光谱，原始孢子原液浓度为10^9孢子/毫升。每个光谱为3个液滴至少15次测量的平均值，每个液滴至少测量5次。(B) 1017 cm–1峰的平均强度，误差条显示标准差。最佳拟合曲线（红线）及其95%置信区间（淡红色区域）展示了峰高与稀释倍数的总体关系。(C) 对(A)中标注的感兴趣区域的特写，所有曲线经过平滑处理并乘以系数2，以便于观察。

4. 咖啡环效应的有效利用与信号增强:

研究团队巧妙利用了液滴干燥过程中形成的咖啡环效应来增强检测信号。如Figure 4A-E所示，当含有金纳米棒和孢子破碎上清液的混合液滴在硅片表面干燥时，溶质在液滴边缘富集形成明显的环状结构。扫描电镜和能谱分析证实，金纳米棒与孢子生物材料在咖啡环区域共同富集并形成紧密接触。纳米棒的聚集产生了强烈的电磁场增强热点，使得CaDPA分子的拉曼信号得到显著放大。拉曼 mapping结果进一步显示，1017 cm⁻¹特征信号在整个咖啡环区域内均匀分布，证明了检测的可靠性。

Figure 4  (A)-(C) 为1:1000稀释液滴干燥咖啡环的SEM图像，逐级放大拍摄，其中(B)插图为金和碳的EDS面分布图。金与碳信号存在显著重叠，这一点在(C)中得到进一步佐证，图中可清晰观察到金纳米棒聚集(橙色箭头)与上清液共存现象。(D)展示咖啡环边缘局部显微图像。(E)对应(D)区域的拉曼面扫描图，显示1017 cm–1峰强度分布。

本研究成功开发了一种基于表面增强拉曼光谱的细菌孢子超灵敏检测方法，通过多方面的技术创新实现了突破性的检测性能。该方法的核心优势在于将物理破碎、纳米增强和浓缩富集等关键技术有机结合，形成了高效完整的检测体系。该方法在实际应用方面展现出显著优势。检测灵敏度已低于多种病原性孢子的感染剂量，如炭疽芽孢杆菌的感染剂量可低至10⁴ CFU，使其在反恐和公共卫生领域具有重要价值。在牛奶这一复杂基质中的成功验证更证明了其在实际场景中的应用潜力，为食品工业的快速筛查提供了新的技术选择。然而，该方法在重现性方面仍存在提升空间，这主要源于液滴干燥过程的不确定性。未来的研究可重点关注检测条件的进一步优化，如通过表面改性改善咖啡环形成的均一性，开发更强的等离激元增强基底，以及建立标准化的样品前处理流程。此外，将该方法与微流控技术结合，实现自动化检测也是重要的发展方向。

原文doi: https://doi.org/10.1021/acssensors.4c03151

来源：微生物安全与健康网，作者~雷晓旭。