细胞冷冻保存

冷冻保存方法分类

　　(1)传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

　　(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

冷冻保存方法步骤

　　(1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

　　(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10%，混合均匀，置于室温下待用。

　　(3)依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

　　(4)离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

注意事项

　　(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80–90%致密度。

　　(2)冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

　　(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

　　(4)冷冻保存之细胞浓度：

　　①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

　　②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

　　③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml。

　　④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

　　(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

冷冻细胞活化

　　1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

　　2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

　　3、材料：37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器。

细胞解冻步骤

　　(1)操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

　　(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

　　(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

　　(4)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

　　(5)取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1：10～1：15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

　　(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

　　(7)若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。