中国工程院食品安全院士团队

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一、研究背景与意义

沙门氏菌污染是禽类产品安全的主要挑战，尽管美国农业部食品安全检验局（USDA FSIS）已实施多项监管措施（如1996年HACCP法规、2020年沙门氏菌路线图等），但2021年美国仍有24.1%的食源性沙门氏菌感染与禽类相关。传统基于培养的富集方法（如最大可能数法MPN）存在固有缺陷：依赖细菌生长导致定量偏差（如应激菌或慢生长菌株被低估）、耗时费力（需多次稀释和长时间培养），且无法直接反映初始污染水平。因此，开发快速、准确、无需富集的沙门氏菌定量方法对食品安全监管具有重要意义。

二、研究方法

本研究构建了“Pathotrak系统分离浓缩+ droplet digital PCR（ddPCR）绝对定量”的无富集检测平台，核心步骤如下：

1. 样品前处理与细菌分离：采用Pathotrak下一代提取（NGE）系统处理325g生禽样品（涵盖鸡胸、鸡腿、火鸡胸等多种基质）。通过专用滤膜袋捕获细菌，经缓冲液洗脱和离心浓缩，获得高浓度细菌悬液。

图1 均质袋滤袋（内袋）置于 Pathotrak 袋内部。Pathotrak 袋的顶部经热封处理以密封样品，并确保液体能流过图 1。Pathotrak 下一代富集（NGE）系统的组件及设置。（A）Pathotrak NGE 系统的各个组件，包括 Pathotrak 袋、接口以及 NGE 过滤器和捕获膜。（B）完整的设置，其中 325 克去骨去皮鸡胸肉在压力条件下置于 NGE 系统中。

2. ddPCR检测优化：比较全细胞直接检测与DNA提取后检测的效率。全细胞样品直接加入ddPCR反应体系，利用 droplets内的热裂解释放DNA；DNA提取组则通过 Prepman Ultra 试剂盒提取核酸。采用ddCheck Salmonella试剂盒（Bio-Rad）进行扩增，靶向沙门氏菌特异性基因invA。

3. 方法验证：
特异性：测试31种沙门氏菌血清型和26种非目标菌（如大肠杆菌、李斯特菌等）；
准确性：通过人工接种沙门氏菌（1~50 CFU/g），分析理论接种量与ddPCR定量结果的线性关系；
基质适应性：评估不同禽类部位对检测效率的影响。

三、主要结果

1. 全细胞ddPCR检测效率显著优于DNA提取法

在培养基和禽肉基质中，全细胞样品的沙门氏菌检出浓度（均值分别为88,456 copies/mL和81,550 copies/mL）显著高于DNA提取组（31,230 copies/mL和22,245 copies/mL，p<0.0001）。这可能是由于DNA提取过程中遗传物质损失减少，证明全细胞直接检测更适合低丰度样本。

图2 利用 ddPCR 测定不同基质中全细胞和 DNA 提取物的沙门氏菌丰度比较。箱线图比较了在鸡肉和培养基两种基质中，使用全细胞或 DNA 提取物制备的反应体系通过 ddPCR 测定的沙门氏菌靶标量（拷贝数 / 毫升）。箱体代表数据的四分位距（IQR），水平线表示回收率的中位数。在两种基质中，全细胞样本（蓝色）的靶标浓度始终显著高于 DNA 提取物样本（绿色）。未接种样本中未检测到靶标。误差棒代表标准差。

2. 方法特异性与准确性优异

特异性：ddCheck试剂盒可检出所有31种沙门氏菌（>600 copies/孔），且对26种非目标菌无交叉反应（<1 copy/孔）；

准确性：理论接种量与ddPCR定量结果呈强线性相关（R²=0.903），斜率为0.99（接近1），残差呈正态分布，表明定量偏差极小； root mean square error（RMSE）为5.42 CFU/mL，精度显著高于传统MPN法（RMSE=21.81 CFU/mL）。

图3 ddPCR 结果与接种水平的线性关系。这是对测得的 ddPCR 结果（CFU/g）与理论接种水平（CFU/g）进行的线性回归分析。回归线以蓝色显示。较深的阴影区域代表均值的 95% 置信区间，而较浅的阴影区域代表个体值的预测区间。该线的斜率（0.99）接近 1，表明 ddPCR 定量准确。对于 N=121，均方根误差（RMSE）为 5.42，R² 值为 0.903。

3. 基质适应性强

对鸡胸、鸡腿、火鸡胸等6种禽类基质的检测显示，所有样品均满足ddPCR所需的≥10,000个有效液滴要求。回收率虽存在细微差异（如鸡翅 plating 回收率19.7%，火鸡腿ddPCR回收率7.1%），但统计学上无显著差异（p>0.05），表明方法适用于复杂禽类基质。

图4 不同禽类基质中沙门氏菌的回收率。采用平板菌落计数（A）和 ddPCR（B）两种方法，对接种水平为 10 CFU/g 的多种基质的回收率进行了评估。y 轴上的回收率反映了在 x 轴对应基质中，检测到的沙门氏菌与接种量的比例。误差棒代表标准差，柱形上方的连接字母表示基于 Tukey-Kramer HSD 检验的统计学显著分组。不共享相同字母的基质之间存在显著差异（p<0.05）。

四、讨论与局限性

本研究的核心优势在于消除富集步骤：传统富集依赖细菌生长，易受竞争菌、应激状态影响，导致定量失真；而Pathotrak系统直接浓缩细菌，结合ddPCR的绝对定量能力（无需标准曲线），可直接反映初始污染水平，且检测周期缩短至24小时内（传统方法需3~5天）。

局限性包括：
ddPCR无法区分活菌与死菌DNA，可能高估风险（需结合PMA/EMA等 viability-PCR技术改进）；
样品处理中细菌回收率的一致性需进一步优化（如膜捕获效率、洗脱效率）；
暂未验证自然污染样品（人工接种可能未完全模拟真实污染状态）。

五、结论与展望

本研究建立的“Pathotrak+ddPCR”无富集方法为禽类沙门氏菌定量提供了快速、准确的新工具，其高特异性、强线性关系和基质适应性使其有望用于食品安全监管与工业检测。未来可通过整合活菌区分技术、优化样品处理效率，进一步提升方法在复杂实际样品中的适用性，为减少食源性沙门氏菌感染提供技术支撑。

参考文献：Armstrong C M, Chen C Y, Xie Y, et al. Quantification of Salmonella in Raw Poultry Using Droplet Digital PCR With a Whole Cell, Enrichment-free Approach[J]. Journal of Food Protection, 2025, 88(5): 100498.

来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。