中国工程院食品安全院士团队

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研究背景

食品安全问题一直是全球关注的焦点，金黄色葡萄球菌作为常见的食源性病原体，具有较强的环境适应性，可引发严重疾病。传统的检测方法如微生物培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）等，存在耗时、成本高、操作复杂等问题。因此，开发快速、灵敏且经济的检测方法至关重要。近年来，噬菌体裂解酶因其对特定细菌细胞壁成分的高特异性结合能力，成为检测细菌的有力工具。结合免疫磁性分离（IMS）技术，可提高检测效率和准确性。

研究方法

建立融合蛋白：将LysGH15的C54A突变体与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合，构建重组蛋白LysGH15-C54A-EGFP。 

免疫磁性微珠制备：利用LysGH15-C54A修饰免疫磁性微珠（LysGH15-C54A-IMBs），用于特异性富集和分离金黄色葡萄球菌。 

荧光检测方法建立：将捕获金黄色葡萄球菌后的免疫磁性微珠与LysGH15-C54A-EGFP孵育，通过荧光光谱仪检测荧光信号强度，实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。 

优化实验条件：包括免疫磁性微珠的用量、LysGH15-C54A的用量以及LysGH15-C54A-IMBs 捕获细菌的时间等。 

检测方法验证：对不同浓度的金黄色葡萄球菌进行检测，评估方法的灵敏度、特异性和抗干扰能力，并通过实际奶样检测验证方法的可行性和准确性。

研究结果

重组蛋白LysGH15-C54A-EGFP的构造及纯化表达：重组蛋白LysGH15-C54A-EGFP的结构框架示意图（图1-A）显示出了重组蛋白LysGH15-C54A-EGFP的结构设计合理，成功表达并纯化。重组蛋白LysGH15-C54A-EGFP的SDS-PAGE电泳图像（图1-B）结果显示，该重组蛋白的分子量约为82 kDa，与预期一致，表明其成功制备且纯度较高，可用于后续的实验研究。 

融合蛋白的表达与活性验证：该图片展示了重组蛋白 LysGH15-C54A-EGFP 的结合活性（图2）。金黄色葡萄球菌USA300菌株用20μmol/L的Hoachst 33342染色，在37℃下孵育10分钟，随后与LysGH15-C54A-EGFP或单独的EGFP在37℃下共同孵育60分钟。蓝色荧光表示在405 nm波长下的定位，绿色荧光表示在488 nm波长下的定位。蓝色和绿色荧光的合并显示了重组蛋白 LysGH15-C54A-EGFP 和 EGFP 与宿主菌株 USA300 的共定位。比例尺为10μm。

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免疫磁性微珠捕获效率：展示了 LysGH15-C54A-EGFP-IMBs 对不同浓度（从1×102到1×106CFU/mL）的金黄色葡萄球菌的捕获效率。实验结果表明，LysGH15-C54A-EGFP-IMBs 对金黄色葡萄球菌的捕获效率在不同浓度范围内表现良好，捕获效率大约在74.81%到 86.33%之间（图3）。这表明所构建的LysGH15-C54A-EGFP融合蛋白对金黄色葡萄球菌具有良好的特异性和结合能力，能够有效捕获目标细菌。

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基于LysGH15-C54A-EGFP的荧光检测方法用于检测金黄色葡萄球菌的示意图（图4）：该示意图清晰地展示了荧光检测方法的原理和流程。通过将LysGH15-C54A与IMBs结合形成捕获剂，利用LysGH15-C54A-EGFP作为荧光信号载体，该方法实现了对金黄色葡萄球菌的特异性识别、富集和荧光检测。这种方法具有操作简便、快速和高灵敏度的特点，为金黄色葡萄球菌的检测提供了一种有效的解决方案。

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捕获条件的优化实验：随着IMBs数量的增加，荧光信号强度的变化是先增大后减小，60μL时达到最佳（图5-B）。随着LysGH15-C54A用量的增加，荧光信号强度的变化先增大后减小，30μg时达到最佳（图5-D）。随着捕获时间的延长，荧光信号强度逐渐降低，25 min 时达到稳定（图5-F）。这表明 25 min 是捕获金黄色葡萄球菌的最佳时间。

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荧光检测方法性能（灵敏性的测试）：图片展示了使用荧光检测方法对不同浓度（从1.0×103到1.0×106CFU/mL）的金黄色葡萄球菌进行检测时得到的荧光光谱（图6-A）。还通过Origin软件对荧光信号值进行拟合得到的金黄色葡萄球菌检测的线性回归曲线（图6-B），其线性方程的相关系数 R²为0.9887，p值小于0.001，表明拟合结果具有很高的可靠性和显著性。

实验结果也表明，基于LysGH15-C54A-EGFP的荧光检测方法对金黄色葡萄球菌的检测具有良好的线性关系，检测范围为 1.0×10³到 1.0×106CFU/mL，检测限低至85 CFU/mL，且整个检测过程可在1小时内完成。这说明该方法具有较高的灵敏度和准确性，能够快速、可靠地检测金黄色葡萄球菌，适用于实际样本的检测需求。

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荧光检测方法性能（特异性及抗干扰性的测试）：同时展示了多种细菌（包括肠球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌（w3275 和 USA300）在浓度为 1.0×105CFU/mL 时的荧光光谱（图7-A），以及使用以LysGH15-C54A为识别探针的基 LysGH15-C54A-EGFP的荧光检测方法对这些细菌进行检测时的荧光信号（图7-B），实验重复了 3 次。从图中可以明显对比出来，金黄色葡萄球菌的荧光信号强度显著高于其他非靶标细菌，表明基于LysGH15-C54A-EGFP的荧光检测方法对金黄色葡萄球菌具有良好的特异性识别能力，能在多种细菌共存的环境中有效区分金黄色葡萄球菌，减少其他细菌的干扰，从而实现对金黄色葡萄球菌的准确检测。

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实际样本检测：对生鲜牛奶样本中金黄色葡萄球菌的检测结果表明，该荧光检测方法与传统平板计数法和PCR检测法具有较高的一致性，回收率为93.09%-101.04%，相对标准偏差（RSD）不超过5.9%，展现出良好的准确性和可靠性。

结论与展望

该研究的建立是基于LysGH15-C54A-EGFP的荧光检测方法，具有快速、灵敏、特异性强等优点，为金黄色葡萄球菌的检测提供了新的技术手段。然而，该方法在实际应用中仍面临一些挑战，如对仪器设备的依赖性较高，限制了其在资源有限环境中的广泛应用；检测过程中的非特异性吸附和复杂食品基质的干扰等问题也有待进一步优化。未来，可以考虑将该荧光检测技术与便携式检测设备相结合，开发出更加便捷、快速的现场检测方法，以满足对食品安全现场快速检测的需求。同时，进一步探索和改进检测方法，降低检测成本，提高检测的准确性和稳定性，对于推动该技术在食品安全检测领域的广泛应用具有重要意义！

参考文献链接：DOI：10.1016/J.ACA.2025.344300

来源：微生物安全与健康网，作者~蒋晓敏。