中国工程院食品安全院士团队

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近日，印度国家肉类研究所的一项新研究带来新的曙光，他们成功开发了一种新型双链qPCR-HRMA技术，能在短短3小时内同时检测出肉类中的这两种致病菌，为食品安全检测提供了更快、更准、更高效的解决方案。

背景知识

李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌是肉类食品中最常见且危害极大的两种致病菌。李斯特菌可引发严重的李斯特菌病，尤其对孕妇、儿童、老人及免疫力低下者有致命威胁；鼠伤寒沙门氏菌则每年导致全球1.5亿人患病，平均6万死亡。传统的检测方法不仅耗时几天，还存在假阴性风险，难以满足现代食品行业快速检测的需求。

研究方法

研究团队开发的双链qPCR-HRMA技术，基于SYBR Green染料的实时PCR检测方法，并结合高分辨率熔解曲线分析（HRMA）。通过精心设计的特异性引物，针对李斯特菌的prfA和鼠伤寒沙门氏菌的STM4497进行检测，分别产生148bp和119bp的扩增产物。实验过程优化了退火温度、引物浓度、循环次数等基本PCR参数，还确定了最佳的熔解速率，以确保两种病原体的独立、同时扩增和清晰区分。

实验过程

细菌培养与DNA提取：从微生物技术研究所获取参考菌株，进行预富集和选择性富集培养后，采用改良的热冷裂解法提取DNA，确保DNA纯度符合后续反应要求。

引物设计与分析：利用PrimerQuest™工具设计引物，通过Primer-BLAST验证特异性，并使用OligoAnalyzer™等工具验证扩增产物的熔解温度差异，确保无交叉反应。

建立双链HRM实时PCR标准化方法：在优化的PCR反应体系中，通过梯度温度设置、调整引物浓度等，确定最佳退火温度和引物组合，实现双链扩增。

熔解曲线分析条件优化：通过调整升温速率，确定最佳熔解速率，以获得清晰的双峰，实现两种病原体的准确区分。

关键结论

高灵敏度：反应灵敏度达2pg DNA，相当于检测124个李斯特菌和100个鼠伤寒沙门氏菌拷贝数；方法灵敏度在肉样中可达150 CFU/mL。

良好特异性：通过体外评估，引物对李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌DNA呈现特异性扩增，无交叉反应。

稳定性强：在故意改变主混料浓度、使用不同 PCR 仪器情况下，仍能获得可靠双熔解曲线。

真实样本检测有效：对来自印度各地的25份商业食品样本和4份监管样本进行检测，结果与VITEK 2细菌鉴定系统匹配，准确检出阳性样本。

研究意义

该技术仅需3小时即可完成检测，极大缩短了检测时间，提高了检测效率，为监管食品检测和临床调查提供了有力工具。同时，其标准化和验证过程遵循国际标准，保证了检测结果的准确性和可靠性，有助于在全球食品安全供应链中更好地检测和管理食源性病原体，保障公众健康。

参考文献：1、Ajay, G et al. “A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products.” Food chemistry vol. 474 (2025): 143245. doi:10.1016/j.foodchem.2025.143245

来源：微生物安全与健康网，作者~张颖。