中国工程院食品安全院士团队

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1. 引言

金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性病原体，需要快速准确的检测方法。传统的培养和PCR方法存在灵敏度低和耗时长的缺点。近年来，基于核酸的荧光生物传感器和等温扩增技术（如RCA）被开发，以提高检测灵敏度和特异性。这些方法可以在复杂基质中直接检测金黄色葡萄球菌，简化了样品处理步骤，满足现场快速检测的需求。

本研究AAP-RCA分析基于一种特定的适体探针（AAP），该探针包含三个结构域：一个用于识别目标病原体的适体结构域、一个环结构域和一个锁探针引物结构域。在目标病原体不存在时，AAP呈现非活性构型，锁探针引物域被退火，下游反应无法启动。然而，当金黄色葡萄球菌存在时，AAP的适体结构域特异性识别并结合病原体，导致其发夹结构展开并转变为活性状态。这种激活使得引物能够与锁探针新进入的引物结合位点杂交。随后，在T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶和dNTPs的参与下，启动RCA反应，产生具有重复g-四重体序列的长线性串联体。在与ThT结合后，g-四重链最终产生大大增强的荧光信号，用于测量金黄色葡萄球菌的存在。这种方法实现了对金黄色葡萄球菌的直接、快速和敏感检测。

方案1. 基于AAP-RCA直接检测金黄色葡萄球菌的无标签策略示意图

2. 结果与讨论

可行性验证与分析

研究人员首先验证了AAP中挂锁探针的引物是否被正确阻断。凝胶电泳结果显示，AAP在没有金黄色葡萄球菌的情况下无法启动RCA过程，证明了AAP的稳定性。荧光光谱法进一步验证了AAP-RCA的性能：在无病原体存在时，荧光信号可忽略不计；而在有病原体存在时，荧光明显增强，表明RCA反应成功产生了g-四重链并增强了荧光信号。

研究人员首先验证了AAP中挂锁探针的引物是否被正确阻断。凝胶电泳结果显示，AAP在没有金黄色葡萄球菌的情况下无法启动RCA过程，证明了AAP的稳定性。荧光光谱法进一步验证了AAP-RCA的性能：在无病原体存在时，荧光信号可忽略不计；而在有病原体存在时，荧光明显增强，表明RCA反应成功产生了g-四重链并增强了荧光信号。

图1. 可行性验证与分析

优化AAP的茎长

AAP被设计为在检测到金黄色葡萄球菌时转变为活性状态。为了优化信号与背景噪声比，需要调整AAP的茎长以避免过度稳定。通过测试不同长度的AAP，发现茎长为18个核苷酸（nt）的AAP表现出最高的信噪比（F/F0），适合用于AAP-RCA实验。这种长度的AAP能够有效减少非目标引物的干扰，确保在目标存在时实现结构切换。

图2. 金黄色葡萄球菌变构示意图及AAP锁定碱基数量对金黄色葡萄球菌特异性结合的影响（S表示发夹探针）

选择性和灵敏度实验

AAP-RCA方法在检测金黄色葡萄球菌时表现出显著的灵敏度和特异性。荧光强度与金黄色葡萄球菌浓度（103 ~ 4×105 CFU/mL）呈线性相关，检出限为48 CFU/mL。该方法对金黄色葡萄球菌的检测信号远高于其他非靶菌，证明了其高特异性。这主要归因于AAP的强亲和力和特异性识别能力。

图3. 选择性和灵敏度实验

真实样品检测及稳定性实验

AAP-RCA方法在复杂生物标本中检测金黄色葡萄球菌的适用性得到了验证。实验结果显示，该方法在自来水、牛奶、生菜和橙汁样品中能够准确、可靠地检测出金黄色葡萄球菌。荧光信号与金黄色葡萄球菌浓度呈线性相关，表明该方法在复杂基质中具有良好的稳定性和灵敏度。同时，AAP-RCA传感器在4°C下表现出高稳定性，9天内信号衰减仅为8.8%。

图4. 真实样品检测及稳定性实验

3. 总结

本研究设计了一种基于AAP-RCA的方法，利用具有RCA扩增的变构适体探针进行无标记、敏感和特异性的病原体检测。这种方法通过消除复杂的步骤，如细菌分离、核酸提取和洗涤，变得更加简单和成本效益高。AAP的高特异性与RCA的高扩增效率结合，使得该策略对金黄色葡萄球菌的检测具有较高的灵敏度和选择性。牛奶样品中金黄色葡萄球菌的成功定量表明，AAP-RCA方法在食品和环境样品中对危险污染细菌的敏感鉴定方面具有令人鼓舞的前景。这种方法的优势在于其简便性和高灵敏度，使其成为一种有前途的检测工具。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136674

来源：微生物安全与健康网，作者~占英。