中国工程院食品安全院士团队

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研究背景

先进治疗药物（ATMPs）是一类创新的治疗方法，用于治疗罕见、严重和慢性疾病，特别是在传统疗法效果不足的情况下。ATMPs主要包括基于体细胞、干细胞、基因和组织工程的疗法，旨在修复受损细胞或组织并治疗退行性疾病。然而，ATMPs的生产涉及体外细胞培养，容易受到微生物污染。由于目前的细胞治疗产品（CTPs）生产工艺无法进行终端灭菌，因此必须在输注前进行无菌检测以确保安全性。目前，行业普遍采用的无菌检测方法为USP<71>方法（美国药典第71章记录的无菌检测法），但该方法最初针对大批量药品设计，不完全适用于ATMPs。此外，该方法依赖14天的培养和肉眼观察浊度来判断污染，其CTPs本身的培养基成分可能导致假阳性结果，且操作繁琐、易引入污染。

近日，新加坡-麻省理工学院研究联盟、新加坡A*SRL实验室、新加坡国立大学、美国麻省理工学院的联合研究团队提出了一种基于机器学习辅助的紫外吸收光谱法，用于实时、无标记、非侵入式的微生物污染检测。该方法利用间充质干细胞（MSC）培养物的光谱数据，训练单类支持向量机（SVM）模型，通过异常检测识别污染。实验证明，该方法可在21小时内检测到低至10 CFU的微生物污染，并在不同供体MSC中验证了其稳健性。这一技术有望整合到CTP生产过程中，实现实时、低成本的无菌监测。

研究主要内容及结果

（1）使用机器学习辅助紫外吸收光谱检测大肠杆菌的时间探究（图1）：为验证所提出方法的灵敏度，本研究考察了污染物检测所需时间。初步实验选用在富含营养的培养基（如DMEM培养基）中生长迅速的大肠杆菌K-12（ATCC 25404）。需注意的是，脐带血来源的细胞治疗产品中偶见大肠杆菌污染，后续实验将扩展至更多微生物。研究将10 CFU的大肠杆菌接种至单一供体（供体A）的MSC培养物中，并在9至24小时间隔3小时采集三次上清液样本。所有样本（含阴阳性对照）均通过光谱仪三重测量，并利用基于供体A无菌PBS样本训练的单类SVM模型评估吸光度数据。模型在约21小时后成功检测到10 CFU大肠杆菌污染，此时所有阴性对照被判定为无菌，阳性对照均为污染（100%真阳性和真阴性）。总检测时间（含样本提取、光谱测量和SVM分析）约为21.5小时，证实该方法可检测低菌量（10 CFU）污染。通过扣除阴性对照（PBS处理的供体AMSC上清）吸光度均值，对比阳性对照（含1000 CFU大肠杆菌的DMEM）和测试样本（10 CFU大肠杆菌）的吸光度变化。结果表明高菌量阳性对照的吸光度增长更显著，而10 CFU样本的变化在18小时后明显，导致21小时被判定为污染。

图1 大肠杆菌加标样本在9小时至24小时时间区间内每隔3小时测得的平均吸光度光谱结果图。a.阳性对照（1000 CFU大肠杆菌加标样本，橙色曲线）扣除同时间点阴性对照样本平均吸光度后的光谱变化。可观察到9小时至18小时期间吸光度快速上升，之后增幅趋于平缓。b.低菌量组（10 CFU大肠杆菌加标样本，深蓝色曲线）扣除同时间点阴性对照后的光谱变化。21小时和24小时时间点的吸光度上升尤为显著。

（2）检测其他微生物污染物：为验证该方法的适用性，研究对USP<71>标准菌株（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等）及缓慢生长的微生物（如痤疮丙酸杆菌）进行了盲法测试。结果表明该机器学习辅助紫外光谱法可广谱检测多种微生物污染（包括快/慢生长菌），灵敏度达10 CFU，且不受培养代次干扰。结合LC-MS揭示的烟酸代谢差异，证实其通过光谱特征识别污染的可行性，为细胞治疗产品的无菌监测提供了高效、通用的解决方案。

（3）机器学习辅助紫外吸收光谱法的稳定性研究（图2和图3）。供体间差异（如组织来源、年龄、性别和生理状态）是影响MSC疗效的关键因素。为验证所开发模型的普适性，研究测试了6种商业供体（B-G）的样本。通过紫外光谱分析发现，供体A和B的无菌样本预测准确率最高（分别为81.2%和65.6%），因此选择它们训练SVM模型。方法对7种微生物的污染检测限仍为10 CFU，真阳性率达92.7%（最低准确率为枯草芽孢杆菌样本）。真阴性率为77.7%，其中14个假阳性样本中10例来自供体F。LC-MS分析表明，供体F无菌样本的烟酸（NA）基线浓度（>2×10⁴ counts）显著高于训练集供体A/B（1.6×10⁴ counts），导致模型误判。总的来说，该方法对多数供体具有良好适用性，但需优化以降低供体间代谢差异（如NA浓度）的干扰，进一步提升特异性。

图2 混淆矩阵与分类报告显示：基于供体A和B的PBS加标样本训练的SVM模型，在评估6个商业MSC供体（B-G）418份测试样本无菌状态时，取得92.7%的真阳性准确率与77.7%的真阴性准确率。

图3 基于供体A和B样本训练的SVM模型对不同微生物在10 CFU浓度下的检测限与准确率

研究结论

本研究开发了一种基于紫外吸收光谱和机器学习的新型快速无菌检测技术，能够以简单、经济和非侵入的方式在21小时内检测低至10 CFU的多种微生物污染（平均真阳性率92%）。该方法通过烟酸/烟酰胺代谢物的光谱差异识别污染，无需复杂培养步骤，且已验证其在跨供体MSCs中的适用性。尽管存在需扩展微生物检测范围、优化供体普适性等局限性，但其快速（<30分钟）、低样本需求（<1 mL）和自动化兼容性优势，使其有望整合到细胞治疗产品（CTP）生产流程中，作为实时污染监测的初步筛查工具。未来通过对接自动化采样系统，可进一步实现连续在线监测，提升CTP生产的安全性控制效率。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41598-024-83114-y

来源：微生物安全与健康网，作者~冯燕梅。