细胞培养中小黑点污染防范处理
发布时间：2023-03-31 浏览次数：230
相信很多老师在细胞培养时，都遇到过细胞养着养着，在显微镜下观察到小黑点，背景比较脏，那么显微镜下观察到了小黑点，是细胞碎片还是污染？
细胞小黑点判断
运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。
培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。
接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。碎片or细菌？一目了然。
处理与预防
1.细胞碎片
化学或者物理的强烈刺激（例如胰酶消化时间过长，吹打细胞太过用力等）往往会导致细胞死亡，产生很多的细胞碎片。在显微镜下进行观察时，可以看到很多呈不规则形态、没有光泽的颗粒粘附在细胞培养皿的底部。
预防方法
状态不好的细胞往往贴壁能力较强，因此切勿用移液器进行强力的吹打，从而损害了健康的细胞；另外，控制好胰酶消化的时间，只需保证大部分正常的细胞被消化下来就可以了，然后更换新的细胞培养皿。
处理方法
a. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，折光属于细胞自身特性，无法清除也无法改变。
b. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞已经分泌的分泌泡，可以先换液后用PBS润洗清除，润洗不能清除的，可以消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液750rpm 离心4min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。
2.细菌污染
细菌污染的细胞，培养基会明显浑浊，静置后会在底部形成一层沙状物，显微镜下观察细胞被细菌包围死亡。
处理方法
细菌污染检测，可以取细胞培养上清1ml左右，接种到3ml LB培养基，摇菌过夜。若培养基明显变浑浊，则证明细菌污染；若无明显变色，证明无污染。
细菌污染的细胞处理后及时丢弃，不会对其他细胞造成影响。
细胞碎片应注意与细菌、真菌污染区分，主要区别在于细胞碎片不会明显增殖，而细菌、真菌在过夜后即可明显观察到增殖，甚至完全遮蔽细胞。
细菌污染一般在污染源进入后1-2天即可爆发，故发现污染时可以自行溯源。
3.真菌污染
真菌污染的细胞，显微镜下可以明显看到树枝状霉菌菌丝或其他形态的菌体，肉眼可以看到明显白色斑点或者培养基内颗粒状物质漂浮。
真菌无须检测，显微镜及肉眼即可分辨。
处理方法
真菌污染的细胞，处理后及时丢弃，同时需要对培养箱及操作台进行消毒处理，避免污染其他细胞。
真菌污染一般在污染源进入2-4天内即可爆发，发现污染时可以自行溯源。
4.支原体污染
支原体污染在国内是普遍存在的问题，大部分实验室缺乏检测及控制支原体污染的方法，导致有很大比例的细胞含有支原体污染。
检测方法
支原体检测方式多种多样，PCR、荧光法、培养法、试剂盒等，不同实验方式检测的灵敏度、特异性、针对的支原体类型都不太一样，所以各种检测方法检出结果有时会有出入。即同一个样本，有的方法检出阳性，有的阴性，有的强有的弱。
支原体处理的，用6孔板培养，每天换液，细胞长满就传代丢弃部分，基本可以保证2-3周清除干净。
5.凋亡小体
体外培养的动物细胞很容易受到培养环境因素的影响，例如营养成分的改变、氧的供给、毒素、细胞代谢产物的积累、pH、 剪切力、细胞密度及微生物污染等。这些环境的改变都有可能诱发细胞的凋亡，从而产生很多分泌的凋亡小体。凋亡小体大多游离在培养基中，但也有一些会通过暴露的核酸彼此之间相互黏连，从而形成一个棕色的凋亡小体团块，没有细胞光泽。
处理建议
细胞培养的过程中一定要控制细胞传代的时间，不能让细胞"长过"；不要使用过酸或者过碱的培养基进行细胞培养；选用内毒素含量较低的血清。
6.血清中的沉淀
磷酸钙是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。
处理建议
经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著增多，对于大多数的细胞而言是不需要进过高温灭活处理的。
温馨提示
▶ 哪些步骤最容易发生污染
最容易导致细菌污染的一个步骤就是细胞在水浴锅解冻后没有彻底消毒。如果这个步骤发生污染的话，细胞接种24小时之内就会明显观察到细胞污染。
另外几个可能导致污染的操作是：放培养基的瓶子或者管子在用水浴锅预热后，没有彻底消毒。实验员在操作过程中枪头有可能接触到被污染的部分而导致细胞污染。为了防止这种情况，容器外表面包括帽子应喷洒75%乙醇彻底消毒，然后用无菌棉垫擦干。
实验员在操作过程中，移液器的枪尖可能会碰到超菌台内壁或者超菌台内放置的其他瓶子或设备，有时可能会碰到包含细胞的细胞培养瓶外表面，甚至会碰到手套，或者实验操作服的袖口。以上所提到的任何一项操作失误，都会导致细菌污染。
▶ 保持无菌工作区是防止污染最佳方式
1. 使用前和使用后，用75%乙醇对所有工作表面进行消毒。如果操作过程发生液体溢出的情况，这一项特别重要；
2. 保持一个整洁的工作空间，工作区应该只包含必须的实验设备；
3. 在实验之前确保已经准备好所有需要的试剂和耗材，避免反复进出操作区；
4. 经常清洁用于细胞培养的水浴锅，经常对细胞培养箱进行消毒。
▶ 培养基污染应该怎么处理
1. 在使用前和使用后，用75%乙醇对培养基和其他试剂瓶子的外表面进行消毒。此外，不要让试剂瓶口敞开过长时间；
2. 尽可能将培养基和其他需要的试剂分装，如果在操作过程中发生错误操作，最好不再使用；
3. 在操作培养基时，请使用一次性的塑料或者玻璃的无菌移液管。每个吸管只有一次，以避免交叉污染；
4. 每天用显微镜观察细胞，密切注意培养基的浑浊度；
5. 避免和其他人共同使用培养基和其他试剂；
6. 每个细胞系使用一瓶培养基。这样可以有效避免交叉污染；
7. 一次只操作一个细胞系，避免细胞之间的交叉污染。
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