培养基发黄怎么办？细胞换液、传代判断与常用细胞系传代参数

发布时间：2026-05-09 浏览次数：18

早上来实验室，打开培养箱发现细胞培养基发黄了——这是细胞培养中最常见的场景之一。该换液还是该传代？这篇把培养基颜色变化的含义、传代操作的关键参数、常用细胞系的传代条件一次过一遍。

01、培养基颜色变化意味着什么

培养基里含有酚红（phenol red）指示剂，它会随 pH 变化而变色。细胞代谢产生的酸性物质不断积累，培养基 pH 就会下降，颜色从红色逐渐变橙、变黄。这个颜色变化直接反映细胞状态：

培养基颜色	pH	细胞状态	处理
红色	7.2-7.4	正常	无需处理
橙红色	约 6.8-7.0	开始走下坡	及时换液或传代
黄色	≤ 6.5	停止生长	必须立即处理
深黄	≤6.0	失去活性	可能无法救回

简单记：由红变橙就该行动，别等到变黄。变黄意味着细胞已经受到影响了。

细胞培养基变色时，关键看汇合度（confluence，即细胞覆盖培养瓶底面的比例）。汇合度 60–70% 以下，只是营养消耗了，换液就行。汇合度到 80–90%，说明细胞已经快长满了，该传代——再不传，接触抑制（contact inhibition，细胞挤太满后停止分裂）会让状态越来越差。

补充一个技巧-半换液：如果细胞密度过低或生长缓慢，可以只换一半培养基。因为细胞自己分泌的生长因子也在培养基里，全换掉反而可能影响生长。

传代的核心是把贴壁细胞消化下来，按比例分到新培养容器里继续养。消化这一步参数最关键：

消化条件：温度室温或 37°C，时间不超过 10 分钟，但必须形成单细胞悬液（细胞一个一个分开悬浮在液体中，不结团）。消化不足细胞脱不下来，过度则损伤细胞。

离心：不超过 500×g（1000 rpm）。转速太高细胞会被压坏，影响活力和贴壁。

吹打：轻柔吹打分散细胞，防止机械损伤。避免刮伤培养瓶壁，否则细胞贴壁会不均匀。

低温消化技巧：如果细胞容易成片滑落，可以试试 4°C 消化，延长时间但更容易获得单细胞悬液。

不同细胞系消化条件差别很大，做之前先查表能少走很多弯路。

细胞系	胰酶	条件	时间	传代比例	长满时间	10cm dish 细胞数
Huh1	EPET	37°C	4 min	1:4	5d	400w
Huh7	EPET	37°C	2 min	1:6	4d	200w
HLE	EPET	37°C	3 min	1:8	3d	200w
HLF	EPET	37°C	3 min	1:8	3d	200w
HepG2	0.25% Trypsin	37°C	4 min	1:3	5d	200w
HUCCT1	0.25% Trypsin	37°C	6 min	1:10	3d	500w
RBE	EPET	37°C	2 min	1:10	3d	200-300w
Huh28	0.25% Trypsin	37°C	6 min	1:3	3d	30w
3T3	EPET	37°C	3 min	1:8	3d	400w

注：EPET = 一种含 EDTA 的温和型消化液，比 Trypsin（胰蛋白酶）对细胞损伤更小。RT = Room Temperature（室温）。

传代比例怎么理解：1:4 表示把一瓶细胞分到 4 个新瓶里。比例越大（如 1:20），每瓶接种密度越低，长满需要的时间越长。

可参考表格：

细胞传代操作不难，难的是拿捏时机和参数。培养基颜色是最直观的判断依据，消化条件跟细胞系密切相关，做新细胞系之前先查参数表，比出了问题再排查要省事得多。

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