明明是同一块96孔板，为什么最先“出事”的总是外圈？

你有没有遇到过这种情况：

同一批细胞、同一份培养基、同一天铺板、同一个培养箱，结果做到最后，偏偏最外圈那些孔总显得“不太对劲”；有时候是CCK-8读数莫名偏低；有时候是细胞状态看起来更差；有时候甚至不是整圈都坏，而是角落最明显，越往中间越正常。

刚开始做实验时，很多人会把这类现象归结为手法问题：是不是加样没混匀？是不是哪几个孔碰巧状态差？是不是操作有问题？但如果这种情况反复出现，而且总是更偏爱“板边边那一圈”，那它大概率不是偶然，而是一个在孔板实验里非常经典的问题：边缘效应（edge effect）。

什么是边缘效应？

边缘效应的核心不是“边缘孔玄学”，而是边缘孔更容易受到蒸发和环境波动影响，因此和中间孔相比，微环境并不完全相同。Mansoury等人在96孔板研究中明确指出，角落和边缘孔比内部孔更容易蒸发，而这种效应甚至可以向内延伸到第二、第三排。

你以为自己在做同一块板，其实细胞感受到的不是同一个世界。

96 孔板看起来是一个规则整齐的矩阵，但对细胞来说，每个孔并不是完全等价的。

中间孔四周都有其他孔包着，温度和湿度变化相对缓冲；边缘孔尤其是四个角，更直接暴露在板边界和外界空气交换影响下，因此更容易出现液体蒸发、温度差异和浓度变化。Mansoury等人把这个问题说得很清楚：外圈孔的蒸发风险更高，而这正是edge effect的关键原因之一。

这种边缘效应带来的问题是一开始往往不是“孔里的细胞全死了”，而是更隐蔽的偏移：培养液体积慢慢减少，溶质和药物浓度悄悄升高，渗透压和营养环境逐渐偏离原本设定的条件。Thermo Fisher的技术文章也有提到，长期培养中外圈蒸发会影响cell culture consistency，而许多研究者之所以不用外圈孔，本质上就是在避免这个问题。

所以边缘孔“看起来不一样”，往往不是错觉

很多人第一次真正意识到edge effect，往往是在结果出来之后。

比如做CCK-8、MTS这类实验时，边缘孔的数值总偏低；做药物实验时，某几个剂量组恰好放在边缘，结果曲线就显得有点怪；做成像时，外圈孔细胞密度和状态总觉得没有中间孔漂亮。

这些现象并不是偶然，Mansoury等人的实验里，外圈孔与中央孔之间的差异并不只是“略有波动”，在某些板型和培养条件下，外圈孔细胞代谢活性可能会明显低于中心孔，而且这种差异并不只停留在最外圈。

也就是说如果你的处理组和对照组在板上分布不均，那么最后看到的“组间差异”，很可能并不全是处理造成的，而是混进了孔位本身的差异。

但边缘效应不只是“蒸发快一点”这么简单。如果说蒸发是边缘效应最经典的一方面，那么另一个更容易被忽略的问题，是铺板早期的细胞分布不均。

Lundholt等人的研究发现，刚铺完细胞的新板，如果直接放进37°C、5% CO₂培养箱，更容易出现外圈孔细胞分布不均的问题；而一个简单便捷的改法是：新铺好的板先在室温静置一段时间，再放入培养箱，这样可以缓解edge effect带来的差异。

边缘效应不一定只发生在培养后期，有时候在细胞还没贴壁、还在沉降的时候，板位差异和温度变化就已经开始影响结果了。所以有些实验表面看起来是“边缘孔后面出问题了”，实际上问题可能从刚铺板就埋下了。

那为什么大家总爱在外圈加PBS？

因为这是最朴素、也最常见的一种“边缘缓冲策略”。

既然外圈孔更容易蒸发，那一种非常直接的处理方式就是：不把关键实验样本放在外圈，而是在外围孔里加PBS、培养基或缓冲液，尽量减轻蒸发和湿度波动。

Mansoury等人的文章就有讨论到，在孔间补充液体可以减轻edge effect，文中也直接写到“adding liquid between the wells reduces the edge effect”。很多新手第一次看到这种做法时，会觉得“这样不是浪费孔位吗？”但从结果质量的角度看，这其实不是浪费，而是在用一小圈孔位，换整块板更稳定的环境。

那边缘孔到底能不能用？

能不能用，不能一句话说死，准确地说：边缘孔不是不能用，而是不能在没有验证的情况下想当然地用。

因为edge effect会受到很多因素影响：板子的品牌和设计不同，表现不一样；培养时间不同，蒸发程度不同；细胞类型不同，对环境波动的敏感性也不同。Mansoury等人的研究就告知不同厂家的96孔板，边缘效应程度并不一致。

所以真正的做法，不是迷信“外圈不能用”，也不是为了省孔位就硬着头皮把所有孔完全等价去用。

更稳妥的思路是：提前在你自己的细胞、实验耗材和实验条件一定的情况下，先做一次板位验证。如果发现外圈和中间孔确实有系统差异，那后续实验就要避开外圈，要么把分组随机打散并加缓冲剂；如果验证后发现差异很小，再考虑如何充分利用板子。

其实孔板不是“外圈不能用”，而是要记住以下三个事：

第一，边缘孔问题本质上是微环境问题。边缘孔问题的来源是蒸发和温湿度波动，不是单纯“边上不吉利”。

第二，边缘效应不一定只影响最外一圈。严重时边缘效应可能会向内延伸，所以不能只靠“目测外圈没问题”就放心。

第三，最好的处理方式不是死记经验，而是让自己的体系先被验证。不同板子、不同细胞、不同实验条件，边缘效应强弱本来就不一样。

说到底，边缘孔不是“怪”，而是它比中间孔更容易体现出系统的不稳定。

所以其实我们应该记住的是：

同一块96孔板上的每个孔，看起来一样，但不一定活在同一种环境里。

你看到的编号只是A1、B1、H12，但对细胞来说，那可能分别对应着不同程度的蒸发、不同的温度缓冲、不同的早期沉降状态。所以以后再听到“边缘孔别随便用”这句话时，别把它当成实验室玄学，因为它真正想提醒你的，不是外圈多可怕，而是多孔板实验里，孔位本身就是一个真实存在的技术变量。

参考资料：
[1]Mansoury M, Hamed M, Karmustaji R, Al Hannan F, Safrany ST.The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.Biochem Biophys Rep. 2021.
[2]Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L.A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.J Biomol Screen. 2003. PMID: 14567784.
[3]Thermo Fisher Scientific.Can You Eliminate the Threats of Edge Effect During Long-Term Cell Culture?/Reducing the edge effect.

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