HE染色老染不好？死磕这5个关键点，从此红蓝分明、背景干净

HE 染色是病理诊断与基础科研中最基础也最核心的技术，优质切片需满足细胞核与细胞质着色对比鲜明、背景干净无杂质、组织结构清晰可辨。但实际操作中，脱片、灰染、核浆界限模糊等问题频发，多数失败并非源于原理不清，而是对关键步骤的细节把控不足。

一、烤片脱蜡：从源头杜绝着色不均

烤片与脱蜡是 HE 染色的第一道门槛，该环节的缺陷会直接导致后续染色失败，且难以通过后续步骤补救。

烤片的核心是让组织与载玻片充分贴合，同时彻底去除石蜡中的水分。常规操作需将切片置于 65℃烘箱烘烤 40 至 60 分钟，温度过低或时间不足会导致组织黏附力不足，染色过程中易脱片；温度过高则会使组织蛋白质变性，引发拒染，最终呈现染色模糊。烤片完成后需立即浸入二甲苯，避免蜡质重新凝固，影响脱蜡效果。

脱蜡的关键在于彻底清除组织表面及间隙的石蜡。推荐采用二甲苯双缸处理，每缸浸泡 12 分钟，若室温低于 20℃，需将二甲苯缸加温至 30℃，否则易出现脱蜡不彻底，表现为切片出现白色斑点或雾化状着色不均。二甲苯需定期过滤并更换，使用过久的二甲苯会因溶解蜡质过多而失效，同时要避免将二甲苯带入后续乙醇梯度，防止产生云雾状背景。

脱蜡后需进行梯度水化，按 100% 乙醇双缸、95% 乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇的顺序依次浸泡，每步 3 至 5 分钟，最后用蒸馏水浸洗。水化不彻底会导致苏木精无法有效结合细胞核，直接造成核染色浅淡。

二、苏木精染液：状态管控决定核色质量

苏木精染色的效果，核心取决于染液的活性状态与染色时间的精准匹配，而非单纯延长染色时长。

苏木精染液易因氧化失去活性，表现为染液呈灰蓝色，表面出现亮晶状氧化膜。氧化膜若粘附在组织上，会形成难以去除的斑点，因此每次使用前必须用定性滤纸过滤，染液出现明显褪色时应直接更换。

染色时间需根据多重因素动态调整，而非固定不变。新鲜苏木精的染色时间通常为 2 至 5 分钟，冬季室温低时可延长至 5 至 8 分钟，细胞密集的组织如淋巴结可适当缩短，纤维丰富的组织则需延长。切片厚度也会影响染色效果，4 至 5μm 的切片为最佳厚度，过厚会导致染料渗透不均，出现核染色深浅不一。

染色后的流水冲洗需充分，建议用流动水冲洗 2 至 3 分钟，去除组织表面未结合的染液，避免后续分化步骤出现非特异性着色，为精准分化奠定基础。

三、分化返蓝：核浆分离的核心调控点

分化与返蓝是决定核浆对比度的关键步骤，也是 HE 染色中最考验操作精度的环节，过度分化或返蓝不足都会导致染色失败。

分化的目的是脱去细胞质中多余的苏木精，使细胞核清晰凸显。常用的 1% 盐酸乙醇分化液，作用时间以数秒至 30 秒为宜，具体时长需根据组织类型调整，肺、肝、肾等实质器官分化时间较短，脾脏等淋巴组织可适当延长。分化的终止时机不能仅凭经验判断，需在显微镜下观察，当细胞质基本无色、细胞核呈紫红色时，立即用流水冲洗终止分化。过度分化会导致细胞核染色苍白，此时可重新进行苏木精染色后再次分化，切勿直接进入后续步骤。

返蓝的核心是将酸性条件下呈红色的苏木精转化为碱性条件下的蓝色，增强核质对比度。分化后需立即进行返蓝处理，可选择 0.2% 氨水浸泡 30 秒至 2 分钟，或用流动水冲洗 10 分钟。返蓝不足会导致细胞核呈棕色，与细胞质界限模糊；返蓝过度则会使细胞质泛蓝，干扰伊红染色。完成返蓝后，需用蒸馏水充分冲洗，去除残留的碱性溶液，避免影响伊红的着色效果。

四、伊红复染：精准把控避免背景干扰

伊红染色的核心是实现细胞质的均匀着色，同时避免背景染污，其关键在于染液维护与脱水步骤的衔接。

伊红染液分为水溶型与醇溶型，科研中常用的醇溶型伊红染色时间为 1 至 3 分钟，染色后需用 95% 乙醇快速浸洗，洗去多余染液。伊红染液的 pH 值对染色效果影响显著，需定期检测并调整，若冰醋酸含量不足，会导致细胞质着色不牢，易在后续脱水步骤中脱色。与苏木精相同，伊红染液也需定期过滤，去除絮状沉淀，防止形成背景斑点。

脱水不彻底是伊红染色后出现背景灰染的主要原因。伊红染色后需按梯度进入无水乙醇，95% 乙醇双缸、100% 乙醇双缸，每缸浸泡 1 至 2 分钟，确保组织内无残留水分。若进入二甲苯后出现白雾现象，说明脱水未尽，需立即退回无水乙醇重新脱水，否则会导致封片后组织结构模糊，前功尽弃。

五、透明封片：守住最后一道质量关口

透明与封片虽处于染色流程末端，却直接决定切片的观察效果与保存寿命，细微疏忽会导致前期所有努力失效。

透明的核心是用二甲苯置换组织内的乙醇，使组织达到光学透明状态。推荐采用二甲苯双缸处理，每缸浸泡 1 至 2 分钟，透明不充分会导致组织折射率不均，镜下观察时层次模糊。操作中需严格避免切片干涸，暴露在空气中超过 30 秒会导致组织收缩变形，产生气泡状空隙，无法通过后续步骤修复。

封片的关键在于中性树胶的浓度与操作手法。树胶过稀易溢出且干燥后产生气泡，过稠则难以均匀铺展，建议用少量二甲苯稀释树胶，降低黏度。滴加树胶时需精准覆盖组织区域，避免过量或不足，盖玻片应纵向垂直缓慢按压，排出气泡，保持下压力 10 秒，防止树胶回缩。封片后需静置至树胶完全干燥，避免移动导致组织移位或气泡产生，干燥后的切片需做好标记，置于避光处保存。

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