六孔板铺板零失败！全攻略奉上，从计数到均匀细胞铺板一步到位
发布时间：2025-10-24 浏览次数：30
一、实验目的
在六孔培养板中接种特定数量的细胞（5 × 10^5 细胞/孔），以获得生长状态良好、分布均匀的细胞单层，为后续实验做准备。
二、实验前准备
①.仪器与耗材: 六孔板、细胞培养皿、移液器及无菌吸头、离心管、血细胞计数板、倒置显微镜、离心机、CO₂ 培养箱。
②.试剂: PBS缓冲液、胰酶消化液、完全培养基。
三、实验步骤
1. 准备工作
吸弃培养皿中的旧培养基，加入 1 mL PBS 缓冲液，轻柔晃动洗涤细胞表面，然后吸弃PBS。此步骤旨在清除残留血清及代谢废物，为胰酶消化创造最佳条件。
2. 细胞消化
向培养皿中加入 1 mL 胰酶消化液，置于显微镜下观察。待细胞间隙增大、形态变圆（约80%-90%细胞回缩）时，立即加入适量完全培养基终止消化。
3. 细胞悬液制备
用移液器轻轻吹打培养皿底面，收集细胞悬液，转移至离心管中，800 rpm 离心 5 分钟。离心后彻底弃去上清，加入 2 mL 完全培养基，轻柔重悬细胞，制备成均匀的单细胞悬液。
4. 细胞计数与密度计算
取 20 μL 细胞原液与 380 μL 培养基混合（稀释倍数：20倍），吹打混匀。取 10 μL 混合液加入血细胞计数板，计数四角四大方格内的细胞总数（n）。
按公式计算细胞浓度：细胞浓度 (个/mL) = (n / 4) × 20 × 10^4。
5. 细胞接种
根据计数结果，调整悬液浓度，以确保每孔接种 5 × 10^5 个细胞。以下是两种推荐的接种方法：
6. 培养前处理
接种完成后，再次于显微镜下检查各孔细胞分布是否均匀。将六孔板在超净工作台内静置约 3 分钟，使细胞初步沉降，然后平稳地移入 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养。
计算6.5个孔所需的总液体量（预留损耗）：细胞悬液体积 = 6.5 × 500 μL = 3.25 mL；完全培养基体积 = 6.5 × 1.5 mL = 9.75 mL；总体积为 13 mL。
若总体积超过15mL，可分装至多个15mL离心管中。
将细胞悬液与培养基在离心管中充分混合（持续吹打1分钟或60次），然后依次加入各孔。为减少沉降差异，建议每加入一孔前（如间隔约30秒）重新吹打混匀悬液30次。
向每孔先加入含有所需细胞数的悬液（例如，若细胞浓度为 1 × 10^6 个/mL，则加入 500 μL）。
再向每孔补加 1.5 mL 完全培养基。
前后左右十字形轻柔晃动六孔板，并在显微镜下初步确认细胞分布均匀性。
方法一：逐孔接种法
方法二：预混集中接种法
四、培养后观察及注意事项
培养约24小时后，细胞通常已完全贴壁并进入对数生长期，此时每孔细胞数量预计可增长至约 1 × 10^6 个，状态适合进行后续实验。
①.无菌与轻柔操作: 所有吹打混匀步骤务必轻柔，避免产生过多气泡，以防止对细胞造成物理损伤和微生物污染。
②.确保铺板均匀: 采用预混法时，坚持“每孔前混匀”的原则是保证各孔间细胞密度一致性的关键。
③.设备检查: 铺板前及移动培养板时，务必确认培养箱及操作台面水平，避免细胞因液体流动而聚集，导致分布不均。
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