"保姆级"教学：CRISPR/Cas9 sgRNA设计及实验流程介绍
发布时间：2025-10-22 浏览次数：250
“前面小编介绍了base editing sgRNA在线工具设计及实验流程，本篇小编将给大家带来CRISPR/Cas9 sgRNA设计的“保姆级"教程及实验操作流程介绍。”表1. sgRNA在线设计网站推荐及特点对比表：
注：这些网站是目前sgRNA设计的常用网站，网站算法不同，各有优缺点。针对同一个基因的敲除，推荐大家多在几个网站进行sgRNA设计，对比结果，根据设计原则选择最优的设计。
小编比较喜欢在CHOPCHOP及DESKGEN(Synthego)在线网站上设计sgRNA,接下来以敲除B2M基因为例，分别使用这两个网站进行特异性sgRNA设计。
一. CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)
1.按照下面的参数输入，点击Find Target Sites！查看设计的sgRNA结果。
2.结果查看，如下图3。结果输出界面由两部分组成，上面是sgRNA基因位置信息，下面是sgRNA结果信息，主要包括sgRNA排序（Rank），GC含量，预测引物二聚体（Self-complementarity评分），编辑效率（Efficiency），脱靶数量（MM0-3，分别为0-3个错配的脱靶位置数）等信息。然后结合下图评判信息，自己判断选择合适的sgRNA序列，一般按照网站给的排序选择前几条进行验证。
图3.输出结果界面（注，如图sgRNA红色代表大量脱靶，绿色代表无脱靶，sgRNA两侧的黑色三角表示sgRNA的方向性，绿色竖线代表潜在的ATG起始密码子)
点开具体的sgRNA序列会展示该sgRNA具体的信息，如图4，显示sgRNA的具体脱靶位置、编辑位点频率，验证用的PCR引物对等信息。最后提下，在输入参数信息界面有Options选项，点开后可根据自己需求选择，分别有全局参数，Cas9，primers等，可进行特定的要求选择，这步大家可尝试选择，不在此具体介绍。
二.DESKGEN(https://design.synthego.com)
1.打开https://design.synthego.com网址，如下图5，选择种属人Homo sapiens, 基因ID输入567(NCBI基因ID)或ENSG00000166710(Ensembl ID)，选择B2M基因，点search;
2.结果界面分两部分如图6上图：Recommended Guides和All Guides，一般会看它推荐的序列。下面推荐的序列列举了四条sgRNA，分别有他推荐序列排名，sgRNA具体序列信息，minimal off targets等信息。如图6下图点开具体的一条序列可以看到设计的sgRNA具体结合B2M基因位置信息。设计出sgRNA的序列，可以构建质粒体外转录功能性sgRNA或直接公司下单合成sgRNA(公司会合成全长crRNA+tracrRNA可以直接使用的功能sgRNA序列）。
接下来我简单介绍下CRISPR/Cas9敲除基因实验流程；
1.材料：
•以human T cell使用CRISPR/Cas9敲除B2M基因为例(不激活/激活2-3天)；
•B2M sgRNA如使用DESKGEN设计(可自行合成sgRNA构建质粒体外转录或可直接公司合成CUGAAUCUUUGGAGUACCUG，含全长crRNA+tracrRNA);
•Cas9酶（可使用Cas9酶表达质粒或体外合成Cas9 mRNA或公司购买mRNA或Cas9酶蛋白）；
•电转仪器Londa 4D(电转仪器也可选择别的公司);
•电转试剂：SF Cell Line 4D-Nucleofector X kit；
•电转程序：EH-115；
2.步骤：
1)收集激活或不激活的human T cell 使用无钙镁离子的DPBS重悬，200-300g离心清洗细胞2次；
2)使用电转buffer 重悬细胞，100ul 电转体系官网推荐1-5e6细胞(需要自己优化细胞密度)；
3)100ul电转体系：75pmol sgRNA和3.0ug Cas9 质粒或mRNA或酶蛋白混匀加入上述待电转细胞中（注：如果使用Cas9酶蛋白，要提前混匀sgRNA和Cas9酶蛋白10-15min，形成RNP然后加入待电转细胞中，这步sgRNA：Cas9质粒或Cas9 mRNA或Cas9蛋白比例根据自己敲除基因进行优化，小编推荐sgRNA:Cas9(RNP)比例可尝试优化180pmol:60pmol或240pmol:120pmol）；
4)将混匀的sgRNA：Cas9质粒或Cas9mRNA或Cas9酶蛋白和细胞转入电转杯中再次混匀，避免气泡，放入电转仪，选择EH-115（使用原代T细胞优化程序，也可根据说明书指导自行进行电转参数优化）进行电转。
5)电转后的细胞立即转入37℃预热的培养基中进行培养，2-4天后检测基因敲除效率。
以上步骤供参考，具体实验细节可根据自己实验进行优化。
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