中国工程院食品安全院士团队

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实验目的

咱们这个实验的核心目标，是定量评估特定处理（比如药物、化合物或微生物感染）对细胞膜完整性的影响，也就是我们常说的“细胞毒性”。

通过测量培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量，你可以精确判断细胞的死亡或损伤程度。

这在药物筛选、评估材料生物相容性等领域是个非常经典且可靠的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）是一种稳定存在于细胞质中的酶，像个安分守己的“居家分子”。

在正常情况下，完整的细胞膜会把它牢牢锁在细胞内。

当细胞膜受到损伤或细胞走向死亡时，这道“大门”就破了，LDH便会泄漏到细胞外的培养基中。

那么问题来了，我们怎么“看见”这些跑出来的LDH呢？

咱们利用一个巧妙的酶联反应：释放到培养基中的LDH催化一个反应，产生NADH；接着，在另一种酶（硫辛酰胺脱氢酶）的帮助下，NADH会将一种叫做INT的无色物质还原成红色的甲臜（Formazan）。

这个甲臜的红色深浅，与释放的LDH量成正比，也就是与死亡的细胞数量成正比。我们用酶标仪在490nm波长下检测这个红色物质的吸光度，就能反推出细胞的死亡情况了。

所需材料与试剂

具体操作步骤

1 — Day 1: 细胞准备与铺板

消化状态良好的对数生长期细胞，离心并用新鲜培养基重悬。

准确计数后，将细胞悬液稀释至目标浓度。

在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，通常细胞密度在3,000到7,000个/孔之间。

将铺好的96孔板放入37℃、5% CO₂的培养箱中培养24小时，让细胞贴壁并恢复状态。

师兄提示：
最佳细胞数需要根据你的细胞类型和药物处理时间来摸索。
处理结束时，空白对照组的细胞密度达到80-90%汇合度是比较理想的状态。（别问我第一次铺得太密结果细胞长老了的惨痛教训）

2 — Day 2: 实验分组与加药处理

吸去旧培养基，用PBS轻柔洗涤细胞一次，然后换上新鲜的低血清（如1% FBS）或无血清培养基。

敲黑板！
血清本身含有LDH，会造成很高的背景值。
所以，强烈建议使用低血清或无血清培养基进行药物处理。
如果必须用高浓度血清，对照组的设置就至关重要了！

在显微镜下观察细胞状态，确保细胞生长均匀。接下来，咱们来设置分组，这是实验成败的关键。

2.1、设置对照组：至少需要设置 样品背景孔 (无细胞，只有培养基)、细胞自然死亡孔 (有细胞，无药物处理) 和 最大酶活性孔 (有细胞，无药物，但在检测前1小时加入裂解液)。

2.2、设置实验组：配制一系列浓度梯度的待测药物溶液，加入到对应的细胞孔中。每个浓度至少设置3个复孔。

将加好药的培养板放回培养箱，根据你的实验设计，继续培养适当的时间（如6, 12, 24, 或48小时）。

3 — Day 3/4: 样品收集与准备

在预定检测时间点前约1小时，从培养箱取出细胞板。

向“最大酶活性对照组”的孔中加入10 μL细胞裂解液（通常是试剂盒自带的），轻柔吹打混匀，然后放回培养箱继续孵育1小时。这一步是给咱们的实验数据定一个“100%死亡”的上限。

到达预定时间后，取出培养板。将培养板在400 g下离心5分钟，目的是让所有细胞或细胞碎片沉到孔底。

小心地从每个孔中吸取90 μL上清液，转移到一个新的96孔板中对应的孔位。注意，千万不要吸到孔底的细胞沉淀！

操作要领！
吸取上清的动作一定要轻柔、缓慢，枪头不要插得太深。
任何粗暴的操作都可能物理性地破坏细胞膜，导致LDH假性释放，让你的数据“虚高”。

4 — Day 3/4: LDH反应与检测

提前将LDH检测试剂盒中的组分解冻至室温。

在检测前，根据样品数量新鲜配制LDH检测工作液。这个工作液必须现配现用，并且要避光。

向含有90 μL上清的新96孔板中，每孔加入45 μL新鲜配制的LDH检测工作液。（记住，上清和工作液的体积比通常是2:1）。

用多通道移液器轻柔吹打混匀，或在摇床上低速振荡几秒钟。注意避免产生气泡。

用铝箔包裹培养板避光，在室温（约25℃）下孵育30分钟。

孵育结束后，立即在酶标仪上测定490 nm处的吸光度（OD值）。

实验结果分析与预期

数据到手，咱们来算算细胞毒性。核心公式如下：

细胞毒性 (%) = [ (OD_待测样本 - OD_{细胞自然死亡}) / (OD_{最大酶活性} - OD_{细胞自然死亡}) ] × 100%

在计算前，所有孔的OD值都应先减去“样品背景孔”（只有培养基）的OD值，以校正背景。

预期结果：随着药物浓度的增加或处理时间的延长，如果药物具有细胞毒性，你将会观察到OD值和计算出的细胞毒性百分比随之升高。

最终，你可以绘制药物浓度-细胞毒性曲线，并计算出半数致死浓度（IC50）。

注意事项与“彩蛋”

☞ 样品时效性

LDH酶在样品中并不绝对稳定。冷冻会使其失活，4℃也只能放2-3天。
所以，采集完上清后，最好当天就完成检测，别拖延！

☞ 气泡是天敌

在加样、混匀、转移上清的每一步都要避免产生气泡。
气泡会严重干扰酶标仪的读数，得到的数据可能就没法要了。

☞ 预实验的重要性

正式开始大批量筛选前，强烈建议先做一个预实验，摸索一下最佳的细胞铺板密度和药物处理时间。
这能帮你节省大量的时间和经费。

这个实验本身不复杂，但魔鬼藏在细节里。

严格按照步骤，注意对照的设置和操作的轻柔。

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