新型 MALDI-TOF-MS 检测法助力艰难梭菌感染诊断
发布时间：2025-04-11 浏览次数：95 分享：
艰难梭菌是一种常见的医院内感染病原体，它能引发腹泻，严重时可导致危及生命的结肠炎。目前，艰难梭菌感染的诊断主要依赖于核酸扩增检测（NAAT）和免疫分析（IA）等方法。这些方法主要检测病原体的存在或毒素 A、B 的浓度，但由于不同菌株产生的毒素 A 和 B 活性差异较大，毒素浓度并不能准确反映疾病的严重程度。而且，其他细菌也可能因水平基因转移产生类似活性的毒素，这进一步增加了诊断的复杂性。
新的 MALDI-TOF-MS 检测方法以天然 RhoA 蛋白为底物，间接测定人类粪便中毒素 B 的酶活性。研究人员先制备了带有生物素标签的重组 RhoA 蛋白底物，利用其与 NeutrAvidin MALDI 芯片的特异性结合，将 RhoA 底物固定在芯片上。当粪便样本中的毒素 B 与芯片上的 RhoA 底物接触时，会使 RhoA 发生酶促糖基化反应。随后，通过 MALDI-TOF-MS 直接检测芯片上的反应产物，根据 RhoA 蛋白糖基化水平的变化，就能间接判断毒素 B 的活性。
图 1：RhoA 凝胶过滤纯化结果，确定目标蛋白所在馏分。
图 2：优化后的 MALDI - TOF - MS 检测毒素 B 活性的工作流程。
研究过程中，研究人员对 RhoA 底物进行了纯化和质谱分析，确保其质量和纯度符合实验要求。在优化检测条件时，对多种 MALDI 基质进行了测试，最终确定 α- 氰基 - 4 - 羟基肉桂酸（HCCA）基质效果最佳。同时，通过调整反应缓冲液的成分、添加蛋白酶抑制剂等方式，提高了检测的稳定性和准确性，并确定 30-80 分钟为最佳反应时间。在检测限实验中，当毒素 B 浓度为 32 ng/mL 时，糖基化 RhoA 离子的平均信噪比达到 17，表明该方法具有较高的灵敏度。
图 3：芯片上完整与糖基化 RhoA 的 MALDI - MS 光谱，体现毒素 B 作用。
图 4：不同浓度毒素 B 处理后双电荷 RhoA 蛋白质谱图，32ng/mL 可现糖基化峰。
研究人员用优化后的检测方法对 20 例疑似艰难梭菌感染患者的粪便样本进行了检测。结果显示，在 4 个样本中检测到了毒素 B 的活性，其中部分结果与医院现有的检测方法一致，但也存在一些差异。例如，有两个样本在医院的 IA 检测中呈阳性，而新方法检测为阴性；另外两个样本则相反。这种差异可能是由于不同检测方法针对的是毒素的不同特性（活性与浓度），以及样本中毒素 B 的活性状态不同所致。
图 5：0.8µg/mL 毒素 B 下芯片变异测试箱线图，展示数据离散度。
图 6：毒素 B 阳性患者样本中 RhoA 底物质谱图，示样本可能含活性毒素。
该检测方法具有显著优势。它无需对病原体进行培养，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，还能提供毒素 B 的活性信息，有助于更准确地评估感染的严重程度。此外，该方法还可以识别其他通过水平基因转移获得艰难梭菌毒素产生基因的细菌。不过，该方法也存在一定的局限性，人类粪便样本的复杂基质会影响 RhoA 蛋白的稳定性，进而对检测灵敏度产生不利影响。
这项研究为艰难梭菌感染的诊断提供了一种新的思路和方法，尽管目前只是概念验证阶段，但未来经过进一步优化和大规模评估后，有望成为临床诊断的重要补充手段，为患者的精准治疗提供有力支持。
参考文献：Dvorak J, Fojtík L, Adámková L, et al. Proof-of-concept MALDI-TOF-MS assay for the detection of Toxin B enzymatic activity in Clostridioides difficile infection[J]. Microbiology Spectrum, 2025: e02453-24.
来源：微生物安全与健康网，作者~徐礼龙。
