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出口食品中腊样芽孢杆菌检测的解决方案(SN/T 0176 2013)

发布时间:2014-11-17      浏览次数:3498    分享:

  我公司针对目前食品行业及质量监测单位检验腊样芽孢杆菌的需求及情况,对腊样芽孢杆菌检验相应的培养基进行了改进,使得腊样芽孢杆菌检出率较之前有很大的改进。扩充并完善了相关的微生物检测试剂,使得技术操作人员能更准确、快捷的检测出目标菌。

  现我公司,依据SN/T 0176-2013 出口食品中蜡样芽胞杆菌检测,推出成套的乳酸菌检验解决方案,为生产企业及检验单位提供方便。

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1SN/T 0176-2013 出口食品中蜡样芽胞杆菌平板计数流程图

 

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2SN/T 0176-2013 出口食品中蜡样芽胞杆菌MPN计数流程图

 

 

1:实验操作所用培养基及生化试剂

 

功能阶段

实验
序号

产品序号

产品名称

规格

类别

样品稀释

1

CP0511A

磷酸盐缓冲液(PBS

225mL×6

盒(瓶装)

CP0640

磷酸盐缓冲液(PBS

225mL×10

盒(袋装)

022117

磷酸盐缓冲液(PBS

250g

瓶(干粉)

CP0630

生理盐水

225mL×10

盒(袋装)

平板分离
与计数

2

028380

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础(MYP

250g

瓶(干粉)

SR0170

多粘菌素B(MYP及胰酪胨大豆多粘菌素

B肉汤配套试剂)1支添加于100 mL培养基中

10000 IU/支×10

盒(西林瓶)

028381

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板(MYP

90mm×20

盒(平板)

MPN法计数

3

024051

胰蛋白胨大豆肉汤培养基
(胰酪胨大豆多粘菌素肉汤基础)

250g

瓶(干粉)

SR0170

多粘菌素B(MYP及胰酪胨大豆多粘菌素

B肉汤配套试剂)1支添加于100 mL培养基中

10000 IU/支×10

盒(西林瓶)

转接与保存

4

024089

营养琼脂平板

90mm×20

盒(平板)

022020

营养琼脂(普通肉汤琼脂培养基)

250g

瓶(干粉)

CP0150

营养琼脂(斜面)

10 ml×20

盒(管装)

生理生化

5

075010

葡萄糖

20

盒(西林瓶)

6

075320

硝酸盐(还原)

20

盒(西林瓶)

029070

硝酸盐还原试剂

(甲液:甲萘胺液,乙液:对氨基苯磺酸)

10mL×2

7

028370

酪蛋白琼脂

250g

瓶(干粉)

8

071803

溶菌酶测试肉汤

20

盒(西林瓶)

071804

溶菌酶质控肉汤

20

盒(西林瓶)

9

029010

革兰氏染色液

10ml×4

10

024060

血琼脂基础

250g

瓶(干粉)

024070

血平板(成品培养基)

90mm×20

盒(平板)

11

026050

半固体琼脂 

250g

瓶(干粉)

075350A

半固体琼脂 

10 ml×20

盒(管装)

075350

半固体琼脂 

20

盒(西林瓶)

12

029063

蛋白质毒素结晶体染色液

10ml×1

13

MID-66

MID芽孢杆菌生化鉴定系统

20/

\"甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)\"

 

SN/T 0176-2013 出口食品中蜡样芽胞杆菌检测  操作步骤

 

第一法   蜡样芽胞杆菌平板计数法

 

蜡样芽胞杆菌检测

 

1.1 样品的稀释

1.1.1 固体和半固体样品:称取25 g样品置于盛有225 mL磷酸盐缓冲液或0.85 %生理盐水的无菌均质杯中,以8000 r/min~10000 r/min的转速匀质1 min~2 min,或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中,用排击式均质器拍打1 min~2 min,制成1:10样品匀液。

1.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL样品置于盛有225 mL磷酸缓冲液或0.85%生理盐水的无菌稀释瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,制成1:10样品匀液。

1.1.3 1 mL的无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL,加到盛有9 mL磷酸缓冲液或0.85 %生理盐水的试管中,充分混匀,制成1:100的样品匀液。

1.1.4 1.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液,直至适宜稀释倍数

 

1.2 样品的接种

根据对样品污染状况的估计,选择2~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,每个稀释度分别吸取0.1mL样品匀液加入MYP平板琼脂平板,然后用无菌L棒均匀涂布于整个平板,注意不要触及平板边缘,每个稀释度接种两个MYP琼脂平板。

 

1.3 培养

1.3.1 在通常情况下,涂布之后将平皿静置10 min~30 min,待样品匀液吸收后翻转平板,30℃±1℃培养24 h。如果培养物的菌落特征不显著,则继续培养至48 h

1.3.2  蜡样芽胞杆菌在MYP琼脂平板上生长的典型菌落为直径2 mm~5 mm,菌落表面粗糙,在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色,环绕产生5 mm宽的卵磷脂酶沉淀环。没有根状生长的特性(蕈状芽孢杆菌形成根状生长的特征)。

 

1.4 菌落计数

选取菌落数在15 CFU~150 CFU的典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板,进行计数

注:如果有很多发酵甘露醇的细菌,会影响到典型菌落,使之减少或消失。少量的蜡样芽胞杆菌无卵磷脂酶沉淀环,这些菌同样需要证实实验。

 

1.5 营养琼脂斜面或平板培养基

从每个平板上挑取5个典型菌落,如无典型菌落,则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,分别接种于营养琼脂斜面或平板,30℃±℃培养24 h,取培养物进行革兰氏染色和证实实验

 

1.6 证实实验

1.6.1 葡萄糖发酵实验:将培养物接种到酚红葡萄糖肉汤中,置于厌氧培养箱中36 ℃±℃培养24 h,振摇后肉汤由红变黄,表明在厌氧条件下蜡样芽胞杆菌分解葡萄糖产酸。

1.6.2 硝酸盐还原实验:将培养物接种到硝酸盐肉汤中,36 ℃±℃培养24 h,加0.25 mL亚硝酸盐试剂A0.25 mL亚硝酸盐试剂B,在10 min内变为红色为阳性反应。

1.6.3 改良V-P实验:将培养物接种到改良V-P培养基中,36 ℃±℃培养24 h,取1 mL培养物置于灭菌空管中加入0,2 mL40 %KOH溶液和0.6 mL5%α-萘酚乙醇溶液和少量结晶肌酸。静置1 h出现伊红粉红色为阳性。

1.6.4 L-酪氨酸分解实验:将培养物接种到L-酪氨酸琼脂培养基上,36 ℃±℃培养48 h在靠近菌落生长的地方培养基为透明的,则表明酪氨酸被分解,阴性则继续培养至72 h,结果仍为阴性的弃去。

1.6.5 溶菌酶试验:将培养物接种到0.001%溶菌酶营养肉汤中,另取培养物接种到普通营养肉汤中作为对照,36 ℃±℃培养24 h,蜡样芽胞杆菌在本培养基中能生长,为阳性反应。如出现阴性反应继续培养 24 h,结果仍为阴性弃去。

1.6.6 符合MYP琼脂上的典型菌落形态,镜检为革兰氏染色阳性大杆菌,呈链状,芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端,并且在厌氧条件下发酵葡萄糖产酸,还原硝酸盐为亚硝酸盐,改良V-P试验阳性,分解L-酪氨酸,能在0.001%溶菌酶中生长的进行如下实验:

1.6.7 蜡样芽胞杆菌与类似菌的鉴别试验:

动力实验:用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30 ℃±℃培养24 h。有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生产,而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。

溶血试验:将疑似菌点种在绵羊血琼脂表面,30 ℃±℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌会观察到强烈的β-溶血反应。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱溶血现象,而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。

蛋白毒素结晶试验:取经30 ℃±℃培养24 h并于室温放置2 d~3 d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,用灭菌蒸馏水做显微涂片。待干燥后将涂片慢慢通过火焰,短暂加热固定。待冷却后,用甲醇盖满涂片,30 s后弃去甲醇,通过火焰使其充分干燥,再将涂片盖满0.5 %碱性复红水溶液或石碳酸复红ZN染色液。用微火轻轻从底部加热玻片至产生蒸汽为止。过1 min~2 min,再重复这个步骤。静置30 s,弃去染液。用蒸馏水充分冲洗玻片,待其自然干燥。在显微镜油镜下观察是否有游离的芽孢和毒素晶体。如果未见游离芽孢,可将培养物在室温下多放置几天后进行试验。苏云金芽胞杆菌产生四角晶形(菱形)的暗色蛋白毒素晶体,蜡样芽胞杆菌不产生毒素晶体。

1.6.8 符合蜡样芽胞菌群特征的,呈强烈溶血,有活泼的动力,不产生蛋白毒素结晶的培养物,可确定为蜡样芽胞杆菌。

 

1.7 可替代的生化实验

如选择API 50 CHB生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统,可按照1.5从营养琼脂斜面或平板上挑取培养物,用生理盐水制备成浊度适当(根据仪器要求)的菌悬液,使用API 50 CHB生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

 

结果计算

 

2.1 平板上的有效菌落数的计算见式(1

a=b/A*C················(1

式中:

a——平板上的有效菌落数;

b——根据证实实验确定为蜡样芽胞杆菌的菌落数;

A——进行证实实验的菌落数;

C——平板上的菌落数。

同一稀释度有效菌落数的平均值计算公式见(2

\"\"···············(2

式中:

\"\"——同一稀释度有效菌落数的平均值;

\"\"——同一稀释度有效菌落数的和。

若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按(3)计算:

\"\"················(3

N——样品中蜡样芽胞杆菌数;

\"\"——连续两个稀释度的有效菌落数的平均数之和;

V——加样量(0.1 mL1 mL;

d——连续两个稀释度中较低的稀释度。

例:将检样10-510-6连续两个梯度稀释液0.1 mL涂布于MYP琼脂平板上,生成的疑似蜡样芽胞杆菌菌落数分别为1371482117个,各取5个进行鉴定,证实为蜡样芽胞杆菌的分别为3444个,则每一稀释度的有效菌落数的平均数分别为10015 CFU。则1 g样品中蜡样芽胞杆菌数为:

(100+15)/(0.1*11*10-3)=115/(1.1*10-6)) =1.0×108 CFU/g

 

2.2 若同一稀释度屁股办上只有一个平板菌落在适宜范围之内,则计算此平板的有效菌落数,然后与其相邻稀释度的有效菌落数的平均值求和,再通过式(3)计算求值,即为每克(或毫升)中蜡样芽胞杆菌。

 

2.3 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜范围内,计算此稀释度的有效菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量,即为每克(或毫升)中蜡样芽胞杆菌数。

 

2.4 若所有稀释度的平板上菌落数均大于150 CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,计算此稀释度有效菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量,即为每克(或毫升)样品中蜡样芽胞杆菌数。

 

2.5 若所有稀释度的平板菌落数均小于15 CFU,则对稀释度最低的平板进行计数,计算此稀释度有效菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量,即为每克(或毫升)样品中蜡样芽胞杆菌数。

 

2.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在15 CFU~150 CFU之间,其中一部分小于15 CFU而另一部分大于150 CFU时,则最接近15 CFU150 CFU的平板进行计数,计算此稀释度有效菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数再除以加样量,即为每克(或毫升)样品中蜡样芽胞杆菌数。

 

蜡样芽胞杆菌平板计数的报告

 

根据MYP琼脂平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数,按2中公式计算,报告每克(或毫升)样品中蜡样芽胞杆菌数,以CFU/g(或CFU/mL)表示;如果最低稀释倍数的两个培养皿均没有菌生长则结果可表述为每克(或毫升)样品中蜡样芽胞杆菌数小于1乘以最低稀释倍数(如果是液态样品的原液,则结果可以表述为每毫升样品中蜡样芽胞杆菌数小于1)。

 

第二法   蜡样芽胞杆菌MPN计数

 

3检验程序

 

3.1 蜡样芽胞杆菌MPN计数法检验程序见图2

 

3.2 MPN计数法试用于蜡样芽胞杆菌数≤103/g的情况

 

操作步骤

 

4.1样品的稀释

样品的稀释按1.1进行.

 

4.2样品的接种和培养

每个样品选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可选择原液),每个稀释度接种3管已酪胨大豆多粘菌素肉汤(TSPB),每管接种1 Ml.(如果接种量超过1 mL,则用双料 TSPB,每管接种10 mL),30 ℃培养48 h

 

4.3 分离

从出现浑浊的试管取培养物划线接种到MYP琼脂上,30 ℃±℃培养24 h。如果培养物特征不显著,可延长培养24 h。蜡样芽胞杆菌在MYP 琼脂平板上典型的菌落为表面粗糙,在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色,环绕产生5 mm宽的卵磷脂酶沉淀环,没有根状生长的特性。

 

4.4 营养琼脂斜面或平板培养

从每个MYP琼脂平板上挑取5个典型菌落,如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触 菌落中心部位,分别接种于营养琼脂斜面或平板,30 ℃±℃培养24 h,取培养物进行革兰氏染色和证实实验。

 

4.5证实实验

证实实验按1.61.7进行。

 

蜡样芽胞杆菌MPN计数结果报告

 

根据证实实验确定为蜡样芽胞杆菌的管数,只要有1个菌落鉴定为蜡样芽胞杆菌,其所代表的TSPB管即为蜡样芽胞杆菌阳性。依据TSPB阳性管数查MPN表(见行标附录B),报告每克(或毫升)样品中蜡样芽胞杆菌MPN值。

 

 

相关标准下载地址:

SNT 0176-2013 出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法

http://www.huankai.com/Train/HBdetail_105020015_100000038658945.html

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