小鼠脾细胞制备、冻存、复苏全流程详解（不止适用于ELISpot）
发布时间：2025-12-16 浏览次数：10
T细胞、B细胞、NK细胞等淋巴细胞是由淋巴器官（淋巴结、脾脏及胸腺）产生的白细胞。由于小鼠血液量少，难以从外周血中分离大量的淋巴细胞，因此常从小鼠脾脏中获取。脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有的淋巴细胞占全身淋巴组织总量的25%。脾脏具有广泛发免疫功能，是淋巴细胞迁移和受到抗原刺激后发生免疫反应、产生免疫分子的重要场所。
小鼠脾细胞是WB、ELISpot、流式细胞术等检测的常用细胞样本之一。建议脾脏在收集8小时内完成细胞分离。仅需对脾脏进行研磨就可轻松获得脾细胞，当然研磨要轻柔，在研磨后及时过滤可获得较好的单细胞血液。分离后的脾细胞可以立即使用，也可以冷冻保存。
样本制备是实验成功的基础，尤其是在ELISpot检测中，样本质量直接影响结果的判读。为此，我们整理了小鼠脾细胞样本制备、冻存和复苏的操作流程，希望能够帮助你获得高质量的实验样本，加速实验进程。
一、脾细胞分离
需提前准备以下试剂或耗材：过滤网或尼龙细胞滤器（无菌）、剪刀、镊子等器械、3mL/5mL无菌注射器（无针头）、无菌培养皿、含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基（含100 µg/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素双抗）、无菌PBS等。
准备工作：取下的小鼠或大鼠脾脏，应立即放入装有5mL培养基的无菌离心管或瓶中。
操作步骤（研磨法）：
1，将小鼠脾脏放在无菌的200目过滤网上或70μm尼龙细胞滤器中，并放置在新的培养皿中，加入少量含10% FBS的RPMI-1640培养基。如果需要，使用剪刀和镊子或钳子去除多余的脂肪和组织。
2，使用注射器活塞平端对组织进行研磨，将小鼠脾脏研磨至无固体状态。需要轻轻研磨，并且避免过滤网与培养皿底直接接触，以免因研磨造成大批细胞死亡。
3，用5mL培养基对滤网上的细胞进行冲洗，并全部转移至新的15mL无菌离心管中。
4，1400 r，离心5min，弃上清。
5，加入5mL红细胞裂解液（如ACK裂解液），裂解5min后再加入5mL培养基终止。
6，300 g，离心5min，弃上清。
7，加入5mL培养基重悬，使用400目过滤网过滤。
8，1400 r，离心5min，弃上清。
9，加入2mL培养基，轻柔吹打，重悬细胞。
除了研磨法制备PBMC单细胞悬液，还可以用酶消化法。操作步骤如下：
1，将小鼠脾脏置于6cm培养皿中，加入1mL冰上预冷的FACS缓冲液（PBS+2% FBS（v/v））。
2，加入3mL新鲜配制的酶液（0.2mg/mL 胶原酶Ⅳ和100U/mL DNaseⅠ），用剪刀将脾脏剪成碎块，置于37℃、5% CO2培养箱中消化30-60min。
3，用移液器吸取细胞悬液至200目过滤网上或70μm尼龙细胞滤器中，过滤到15mL离心管中，并用2-5mL培养基冲洗。
4，后续操作与研磨法的步骤4-9相同。
二、脾细胞冻存
以上重悬获得的脾细胞可以直接用于ELISpot、流式细胞术、WB等免疫研究。如果需要冻存细胞，请参考以下步骤：
操作步骤：
1，接着研磨法的第8步操作，将离心后的细胞弃去上清，用细胞冻存液将细胞稀释到冷冻保存浓度。如果用含血清冻存液，细胞浓度常为5-25×106个/mL，若为无血清冻存液，则稀释至1×106个/mL。
2，将细胞悬液进行分装，例如每支冷冻管分装1mL细胞悬液，并将冻存管转移至冻存容器中，确保细胞处于悬浮状态。
3，迅速将冻存容器置于-80℃的冰箱中，最少存放4h，最多存放1周。使用程序降温盒可直接放于-80℃冰箱，传统冻存方法可按照4℃半小时、-20℃一小时、-80℃过夜的顺序逐步保存。
4，将冷冻管从冻存容器转移到-150℃的冰箱或液氮罐中进行长期保存。
三、脾细胞复苏
1，提前将水浴锅加热至37℃，并将培养基置于其中进行预热。
2，取15mL的离心管，加入2-9mL培养基，置于水浴锅中备用。
3，将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅。
4，待冻存管中尚存微小冰晶时，向其中加入0.5-1mL培养基，重悬细胞。
5，用纸擦拭水渍，并将预加培养基的离心管移至超净工作台。用移液器吸取细胞，缓慢移至准备好的离心管中。再用1mL培养基冲洗细胞冻存管，并将其移至离心管中。
6，300 g离心10min。离心是为了去除DMSO。
7，弃上清，加入5mL细胞培养基，用移液器反复吹打，重悬细胞。
8，细胞计数并确定细胞活性。目前基本使用自动细胞计数仪完成细胞计数和细胞活率测定。用显微镜进行台盼蓝染色计数基本被淘汰了。
四、细胞冻存和复苏注意事项
实时测试新鲜分离的细胞属于理想情况，在小规模研究中可行。然而需要对多个样本进行批量检测就比较难实现了，比如同一供体或患者在特定疾病进程、治疗或疫苗接种方案中不同时间点获取的样本。
虽然冻存会影响细胞的活性和功能，但通过优化和标准化的细胞冻存和复苏技术，可确保冻存细胞与新鲜细胞具有相近的功能活性。
细胞冻存时会加入二甲基亚砜（DMSO），可提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，进而减少冰晶形成对细胞造成的损伤。
细胞冻存的原则是“慢冻快融”。细胞冻存的最佳降温速率是1℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。可用自动化程序降温仪、程序降温盒、CoolCell程序降温盒等。
冻存培养基会影响冻存细胞的功能。以前冻存培养基主要由高比例血清与DMSO混合物组成。细胞接触具有抑制作用或非特异性刺激作用的血清，可能对检测结果产生不利影响，如无法检测到目的反应或出现高背景反应。实验发现，在同一实验室或不同实验室间，相同样本添加不同批次血清的培养基进行冻存，其ELISpot检测结果可能存在差异。
细胞在-70至-80℃之间冻存后应移至液氮中长期储存，以防止功能损失。细胞在-80℃时尚未完全冷冻，还存在一些代谢活性。液氮保存有两种方式：细胞完全浸没在液氮中（-196℃）或储存在液氮的气相（-150℃）中。温度低于-137℃时，分子运动停止，生物活性完全暂停，因此，两种液氮储存方式都可以保存细胞。
细胞复苏需在37℃快速完成。培养基应该提前在37℃水浴锅中预热。在冻存管中仍有少量冰晶残留时，缓慢加入培养基。如果不使用预热的培养基，快速加入或待冰晶完全融化后再加入培养基，可以会对细胞造成渗透压冲击损伤。
常用方法是将冻存管放在37℃水浴锅解冻。一支1mL的冻存管解冻约需150-160s。当管内温度达到10℃时，冰晶完全融化。解冻过程切勿摇晃冻存管，否则冰晶会刺破细胞膜。自动化解冻系统操作简单、重复性好，可有效避免污染。
如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远（步行超过1min），要把细胞先置于干冰上，再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里，可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。细胞冻存管装在PE手套中，可以预防污染。
细胞复苏后常见细胞聚团。一旦形成团块将无法使其重悬。细胞聚团是死亡细胞释放DNA所致，建议在解冻培养基中添加脱氧核糖核酸酶（DNase）或超级核酸酶。如SuperNuclease®可有效清除DNA，防止细胞聚团，提高细胞回收率，且对ELISpot检测结果无影响。在进一步处理细胞前，用不含核酸酶的培养基清洗细胞，可去除残留的核酸酶。
细胞复苏需要一段时间。如果复苏后的细胞密度低于80%，48小时内不要换液，待细胞形态、生长速度等恢复正常，再进行传代等操作。
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