一文说清楚大肠杆菌表达系统
发布时间：2025-09-05 浏览次数：11
大肠杆菌（E. coli）表达系统是一种被广泛用于重组蛋白表达的原核表达系统，其特点是：遗传背景清晰、操作培养条件简单、表达成功率高、时间短、成本低，被广泛地应用于科研、工业酶、疫苗、重组蛋白药物等领域。
大肠杆菌表达系统的优势与劣势
大肠杆菌表达系统的工作流程
大肠杆菌表达系统操作比较简单，对实验室的仪器要求比较低，成本也比较低，因此大部分实验室都可以开展大肠杆菌的表达。
1. 表达方案的设计
首先要确定目标蛋白的基因序列，这里值得注意的是，目的基因的信号肽序列是不需要的，大肠杆菌一般都是做胞内表达，如果要做周质空间的分泌表达，采用载体pET-22b自带的PelB信号肽就可以，实际应用中这种设计比较少，通常表达量也比较低，仍然也可能形成包涵体。
其次是表达载体的选择：pET系列、T7启动子、高表达、最常用；pGEX系列、GST标签、增强可溶性表达；pMAL系列（MBP标签）、促进折叠、减少包涵体的形成；pBAD系列适合毒性蛋白；pCOLD低温诱导、减少包涵体形成等。
纯化标签的选择：His标签通用性强、纯化成本低、操作简单、包涵体也可以纯化，一般情况下是首选；对于难溶的蛋白，可以选择促溶标签GST、SUMO、MBP；对蛋白纯度要求高，可以选择Strep和Flag。
2. 表达载体的构建
表达载体构建：酶切连接法、无缝克隆、gateway等；其实现在在做基因合成的时候，可以直接跟基因合成公司沟通，要求将目的基因装载到指定表达载体上，这样基因合成后，就可以直接收到表达载体，这样更方便。
3. 制备感受态和转化
制备感受态和转化是比较容易的，这里主要是对宿主菌的选择。
用于克隆阶段，主要是用大肠杆菌DH5α和TOP10，克隆宿主菌主要特征是消除了内切酶活性，可以防止质粒降解，支持蓝白斑筛选，便于实现表达载体的扩增。
表达宿主的选择相对克隆宿主来说要复杂一些：
4. 表达条件的测试
影响大肠杆菌表达条件主要是表达温度、诱导剂浓度、诱导时间和培养基；摇床的转速、摇瓶装液量会有一定影响，一般情况下建议摇瓶装液量为1/3。
5. 大体积的发酵和纯化
大体积的发酵条件，一般是根据之前小试的表达条件优化得到最佳条件进行就可以了；纯化一般根据表达设计时的融合标签来选择对应的纯化填料，进行标签特异性亲和纯化。
表达讲到这里就差不多了，最后我们来说说大肠杆菌最容易碰见的问题——包涵体
包涵体主要是指在原核表达（大肠杆菌）中，外源蛋白高表达时，因为折叠错误或者超量聚集而形成的无膜包裹的颗粒体（疏水性强），主要是由部分或者完全变性的重组蛋白组成。
面对包涵体我们不用担心和感到失望，包涵体只是折叠错误的目的蛋白，而且纯度高，也是有很多用途的，比如可以用作抗原，还可以复性，部分复性后有良好的生物学活性。
总结：大肠杆菌表达系统是一种成熟、简单、成本低、表达成功率高、而且容易操作的表达系统，几乎在每个实验室都可以搭建大肠杆菌的表达平台，是蛋白表达入门最佳选择，也是值得研究的蛋白表达平台。
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