细胞铺板总是铺不均匀怎么办？
发布时间：2025-08-07 浏览次数：7
我们都知道在细胞实验中，铺板均匀性直接影响实验结果的可靠性与重复性。但是在日常细胞培养过程中，我们经常遇到这样的问题，例如细胞聚集、边缘效应或密度不均等。所以，这期主要介绍“细胞铺板总是铺不均匀怎么办？”
在这之前我们先明确“细胞铺板不均匀会对后续实验产生什么影响？”
(1) 细胞生长的差异性: 如果细胞铺板不均匀，不同区域的细胞密度和分布可能会有差异。这会导致细胞生长的差异，某些区域的细胞可能会过度生长，而其他区域的细胞可能会停止生长，影响实验结果的可靠性。
(2) 实验结果的不准确性: 细胞铺板不均匀可能会导致实验结果的不准确性。例如，在细胞荧光染色(IF)实验中，如果细胞密度不均匀，荧光信号的强度可能会有差异，影响对细胞的定量分析。
(3) 实验数据的不可重复性: 铺板不均匀可能会导致实验数据的不可靠性。例如，在细胞增殖(CCK8/MTT)实验中，如果细胞密度不均匀，细胞数量的测量可能会受到干扰，导致相同干预浓度的不同孔间OD值差异很大。
(4) 细胞行为的变化: 细胞铺板不均匀可能会导致细胞行为的变化。例如，在细胞迁移((划痕)实验中，如果细胞密度不均匀，细胞的迁移速度和方向可能会受到影响，导致实验结果的不可靠性。
那要如何解决“细胞铺板不均匀”的问题呢？
1. 首先要了解培养皿的规格、型号以及适用范围。不同的细胞培养皿规格、型号以及适用范围各不相同。例如: 小规模实验(神经元培养)可以选择35mm皿，培养基量2-3ml，避免细胞过度密集；药筛实验(CCK8检测)可以选择使用96孔板(单孔面积0.32cm2)，每孔加0.1ml培养基，细胞量约1x104；大规模生产(疫苗纸杯额)可以采用150mm皿或多层培养瓶，单次培养可收获2x107细胞。
2. 如何计算细胞接种密度。首先选择合适的细胞培养皿进行实验，确定细胞培养皿的面积，在细胞传代时，对细胞进行计数，计算出大概得目标细胞密度，再计算出细胞的接种量，避免细胞过多或多少。
例如: 10cm皿(面积60.8cm²)接种成纤维细胞，密度2×10⁴ cells/cm²。
3. 细胞培养手法。
(1) 对于96孔板，每孔通常加入100μL细胞悬液。加样方式为倾斜枪头，从孔的左边靠近底部缓慢加入(加样过快同样容易导致细胞聚集)。建议: 每加完半拉板子时，把细胞重新混匀，继续加样。加样结束后，镜下观察如有局部不均匀现象，可以采取敲击法。具体操作如下: 将板子置于台面上，左手持住板子的左边，右手轻轻敲击板子的右边缘(5-8次)，力度太强或次数太多会反而更易导致细胞聚集。将板子顺时针旋转，依次敲击剩余三个边(据说逆时针效果不好)，静置约5-10分钟后，放入37℃培养箱。
(2) 8字法。这种方法也是大家最常见的细胞摇匀方法。横向8字摇匀法参考下图，摇动次数根据镜下观察和个人力度具体分析(参考: 保证液体不被晃动出去，8字晃动5次理论上就可以基本晃匀)。摇匀结束，切忌在镜下移动观察视野太久，以免伴随着轻微的移动，细胞又往中间聚集。
(3) 十字法: 细胞铺完板后，在水平方向上，上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次。另外，同样不建议放到镜下长时间去观察。
(4) 震荡法: 细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。值得注意的是，这种方法板子接触振荡器后增加了染菌的风险，而且转速的调节和时间的掌握比较困难。
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