方法验证研究中，自然污染样品和人工污染样品如何选择？
发布时间：2025-07-23 浏览次数：23
来源：“六扇门Study”公众号，作者~SIXDoors
小六之前分享过很多关于方法验证（validation）的知识，不管AOAC认证通则还是ISO16140-2验证通则，还是GB4789.45微生物方法验证通则中都有关于准确度或者相对正确度或者重复性的验证要求。这部分验证要求实验室在验证的基质中涵盖高浓度、中浓度、低浓度及自然污染样品的测试，来验证方法与参比方法的一致性。其中涉及到自然污染样品、人工污染样品及混合污染样品，他们代表什么？如何选择呢？
1、先理解这三类样品的区别
ISO16140-2中也给出的相关定义描述，小六增加了特征介绍，可作为参考。
自然污染样品
在没有对样品进行任何已知的微生物污染操作的情况下，收集到的含有目标微生物的样品。
来源于真实的生产环境或流通环节（如田间、屠宰场、生产线、仓库、零售店、餐厅等），是验证方法在真实场景下性能（特别是灵敏度、特异性）的理想样品类型。
混合污染样品
在自然污染样品菌浓度较高时，通过将一份/多份自然污染的样本与未被目标微生物污染的样本混合，人工制备得到的样本。其主要目的是为了稀释自然污染样本中的目标菌浓度或改变基质的组成。
在特定情况下（如研究非常低的污染水平或目标生物无法自然存在时），ISO 16140-6中有说明：有时允许在混合样本中加入极低浓度的纯培养目标菌，但需要明确说明。
人工污染样品
将纯培养的目标微生物（一种或几种）悬浮液，定量添加到一份或多份未检测到目标微生物的样品中，制备得到的样本。人工污染样品能准确控制目标菌的污染水平（特别是在阴性和高浓度之间），是定量方法准确度研究的理想样本类型。研究实验室间再现性一般选择人工污染样品。
局限性: 无法完全模拟目标菌在真实环境中的状态，如亚致死损伤，背景菌群干扰以及基质内存在抑制情况。
2、验证研究中，如何选择？
下图是GB4789.45中给出的样品类型选择规则：
在GB4789.45实施指南中规定了方法比较研究和实验室间协作研究中使用各种样品的优先次序和信息。
第一选择:自然污染样品
理想的自然污染样品对目标生物体的污染程度接近于（预期的）检测水平。
第二选择:混合污染样品
如果自然样品的污染水平过高，可以通过使用含有正常背景菌群的类似物品进行稀释，以减少自然污染样品的浓度。混合样品应使目标微生物分布均匀。
第三选择:人工污染样品
人工接种的菌株应优先从同一种物品中分离出来，并考虑目标生物体的自然多样性，如血清型、基因型和表型。
目标菌群水平应代表该产品中自然发生的污染。该物品应包含“正常”的背景微生物群。
第四选择:标准物质
标准物质，例如有证标准物质，包含适当但定义明确的目标分析物(微生物)水平，且处于稳定的应激状态，可用于定性和定量分析方法中对样品进行加标。对于定性研究，它们的使用应受到限制，只适用于只有少数菌株或食物来源的目标分析物血清型可用的情况。
方法验证者应根据验证目的和实际情况因地制宜选择适合的样品污染方式。
GB 4789.45刚刚发布两年，对于无论是标准修订者还是其他的方法验证者来说，方法验证还是个较新的话题，应该在保证科学严谨的前提下灵活采用各类样品制备方式，来获得适合验证目的适宜目标微生物浓度的样品。
循序渐进，不断提高样品制备水平，从而可以保证方法验证的科学性和可行性。
