中国工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

研究背景

在当今社会，城市污水、水产养殖废水和医疗废水已成为沙门氏菌的重要储存库和传播源。沙门氏菌是一种常见的人类食源性病原体，广泛存在于人和动物体内，并通过粪便排泄到环境中。它能在未经处理的粪便和废水中存活五个月至两年之久，感染后可引发多种疾病，如菌血症、胃肠炎、食物中毒等。因此，快速检测废水中的沙门氏菌对于有效降低疾病传播风险、保障公共卫生安全至关重要。

然而，目前的沙门氏菌检测方法存在诸多局限性。传统的培养技术虽被视为检测“金标准”，但检测周期长达4至7天，难以及时发现沙门氏菌污染；免疫学方法因缺乏特异性靶向抗体、存在交叉反应等问题而应用受限；分子生物学技术如多位点序列分型（MLST）和聚合酶链反应（PCR）等需要昂贵设备和专业人员操作；生物传感器方法也因成本高昂难以广泛推广。此外，以往的DNA分子检测方法无法区分活菌和灭活菌的DNA，可能导致对沙门氏菌风险的高估，而RNA检测方法又存在提取复杂、成本高等问题。

创新检测平台的诞生

在这样的背景下，一项创新的研究成果应运而生。2025年5月21日，《Microorganisms》杂志发表了一篇题为《Establishment of a Sensitive and Visual Detection Platform for Viable Salmonella in Wastewater That Combines Propidium Monoazide with Recombinase Polymerase Amplification—CRISPR/Cas12a System》的文章，介绍了一种新型的检测平台，该平台结合了碘化丙啶单氮杂卓（PMA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a系统，专门针对废水中的活菌沙门氏菌进行快速、灵敏且可视化的检测。

创新点及优势

这项研究的创新之处在于巧妙地整合了多种先进技术。PMA能够选择性地与死细胞的DNA结合，阻止其在后续的扩增反应中被检测到，从而有效区分活菌和死菌；RPA则是一种等温扩增技术，具有快速、操作简便、成本低等优点，相比传统的PCR技术，它不需要复杂的热循环设备，且能在较短时间内完成DNA的扩增；CRISPR/Cas12a系统则以其高特异性和灵敏度著称，能够精准识别目标DNA序列，并通过其独特的侧切活性激活荧光信号，实现可视化检测。三者的结合，不仅弥补了各自单独使用时的不足，还充分发挥了各自的优势，为沙门氏菌的检测提供了一种全新的解决方案。

研究结果

高特异性和灵敏度

特异性：对15种常见病原体进行检测，仅沙门氏菌属（鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌B型、肠炎沙门氏菌）显示荧光信号，其他菌株均无反应，表明该系统具有高度特异性。

图1 15种常见病原体的可视化检测结果（a）、荧光值和Ct值（b）。（泳道1至15分别对应鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌B型、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、产气肠杆菌和枯草芽孢杆菌，C表示阴性对照。）注：不同大写字母表示荧光值之间存在显著差异（方差分析，P<0.05），不同小写字母表示Ct值之间存在显著差异（方差分析，P <0.05）。

灵敏度：在污水中，该系统对活沙门氏菌的最低检测限为10¹ CFU/mL，且在10¹至10⁸ CFU/mL浓度范围内均能产生明显的荧光信号。

图2 浓度范围为10⁰至10⁸ CFU/mL的沙门氏菌的可视化检测结果（a）、荧光值和Ct值（b）。图表中，条形图表示平均值，误差线表示标准差。

实际应用

污水中活沙门氏菌的检测应用

人工接种废水检测：在人工接种不同浓度活沙门氏菌的废水中，该系统能准确检测到10¹至10⁸ CFU/mL的活沙门氏菌，而灭活沙门氏菌无信号。PCR和凝胶电泳结果进一步验证了该系统的有效性。

图3 浓度范围为10¹至10⁸ CFU/mL的废水中灭活及活沙门氏菌的可视化检测结果（a）、凝胶电泳结果（b）、荧光值和Ct值（c,d）。图表中，条形图表示平均值，误差线表示标准差。

实际废水样本检测：对24份实际废水样本进行检测，其中8份样本（#2、6、10、12、13、16、20、24）显示明显的荧光信号，荧光强度和qPCR值一致，表明该系统在实际环境中具有良好的适用性。

图4 24份实际废水样本检测结果的可视化检测（a）以及荧光值和Ct值（b）。图表中，条形图表示平均值，误差线表示标准差。

讨论与挑战

尽管PMA处理能够有效区分活菌和死菌，但在实际应用中，仍需进一步研究如何优化PMA的处理条件，以确保其在不同类型的废水样本中都能发挥最佳效果。此外，对于现场应用而言，还需要开发便携式的荧光检测设备，以便于在没有专业实验室设备的情况下进行快速检测。同时，实际废水样本中复杂的污染物成分可能会对DNA提取和扩增过程产生干扰，如何快速、高效地从环境样本中提取纯净的DNA，减少抑制物的影响，也是未来需要解决的问题。而且，一些废水样本的高浊度和颜色可能会阻碍蓝光的有效照射，进而影响PMA与DNA的结合效果和检测灵敏度，这也是未来研究需要重点关注的方向。

总结与展望

这项研究成功建立了一种快速、灵敏且可视化的检测平台，能够有效检测废水中的活菌沙门氏菌，为废水处理厂和农村污水处理设施中的病原体监测和早期预警提供了有力的技术支持。通过优化PMA处理条件和整合RPA与CRISPR/Cas12a技术，该系统不仅提高了检测效率，还降低了检测成本，有望在实际的废水监测工作中得到广泛应用。

随着技术的不断进步和相关研究的深入，相信该检测平台将不断完善。研究人员可能会进一步探索PMA与其他检测技术的结合，拓展其应用范围；同时，开发更加便携、快速、准确的现场检测设备，使其能够更好地适应复杂的环境条件，为保障公共卫生安全和环境保护做出更大的贡献。此外，对于其他类似的病原体检测，该研究也提供了一种可借鉴的思路和方法，有望推动整个微生物检测领域的发展。

参考文献：Liang J, Sui X, Xu Y, et al. Establishment of a Sensitive and Visual Detection Platform for Viable Salmonella in Wastewater That Combines Propidium Monoazide with Recombinase Polymerase Amplification—CRISPR/Cas12a System[J]. Microorganisms, 2025, 13(5): 1166.

来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。