中国工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

在食品安全领域，致病菌的快速、准确检测一直是研究的重点。近期，《Food Chemistry》杂志上发表的一篇研究论文介绍了一种新型的双重实时荧光定量PCR-高分辨率熔解分析（duplex qPCR-HRMA）技术，为检测肉类中的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）提供了新的解决方案。

致病菌检测的重要性

单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌是两种常见的食源性致病菌，它们在全球范围内对食品安全构成了严重威胁。单核细胞增生李斯特菌主要通过污染的肉类、乳制品等传播，可导致严重的李斯特菌病，尤其对孕妇、儿童、老年人和免疫力低下者危害极大。鼠伤寒沙门氏菌则广泛存在于动物源性食品中，每年导致约1.5亿人患病，平均6万人死亡。传统的检测方法如培养法虽然准确，但耗时长，无法满足现代食品行业快速检测的需求。因此，开发一种快速、灵敏且准确的检测技术显得尤为重要。

双重qPCR-HRMA技术原理

qPCR是一种基于荧光信号的实时定量PCR技术，能够快速、准确地检测目标DNA序列。HRMA则是一种基于PCR产物熔解曲线差异的分析技术，可以在不使用额外探针的情况下区分不同的DNA序列。双重qPCR-HRMA技术将两者结合，通过设计针对单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性引物，分别扩增两种致病菌的特定基因片段，然后通过HRMA分析其熔解曲线的差异，从而实现对两种致病菌的同时检测。

灵敏度与准确性

研究中，双重qPCR-HRMA技术表现出极高的灵敏度和准确性。实验结果表明，该技术的反应灵敏度可达2皮克（pg）DNA，相当于单核细胞增生李斯特菌124个拷贝和鼠伤寒沙门氏菌100个拷贝。

表1 双重qPCR-HRM检测方法的反应灵敏度。灵敏度评估采用单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的DNA十倍梯度稀释系列，起始浓度为20 ng。测试了每个稀释系列中两种菌的双重检测情况，并记录熔解值。

图1 用于确定反应灵敏度的高分辨率熔解分析。(A) 标准化温度曲线图表显示红色簇中双重检测的双拐点，(B) 温度偏移差异曲线图表显示熔解曲线形状和颜色的差异（红色簇——在五个稀释系列内检测到单核细胞增生李斯特菌在76℃和鼠伤寒沙门氏菌在80℃的双拐点反应）。在第六个稀释系列中仅检测到（蓝色簇），表明该反应足够灵敏，可检测到直至第五个稀释系列的两种病原体。

在模拟污染的肉类样本中，该技术的检测限为每毫升150个菌落形成单位（CFU），这一检测限远低于传统培养法和其他一些分子生物学方法。此外，该技术还通过了国际标准ISO 22118:2011的标准化和验证，确保了其在实际应用中的可靠性和准确性。

实际应用

为了验证该技术的实际应用价值，研究人员进行了多方面的实验验证。首先，通过比对不同致病菌的熔解曲线，验证了引物的特异性。接着，通过稀释系列实验确定了反应灵敏度，并在模拟污染的肉类样本中测试了方法灵敏度。此外，还通过改变反应体系和设备等条件，评估了该技术的稳健性。最终，通过盲测验证和实际样本检测，进一步证明了该技术在检测真实世界样本中的有效性和可靠性。

表2 对25份商业样品（C-1至C-30）和4份监管样品（R-1至R-4）的实际样品评估。所开发的qPCR-HRM检测结果经VITEK 2细菌鉴定系统（美国生物梅里埃公司）验证。

未来展望：食品安全检测的新方向

双重qPCR-HRMA技术的诞生，标志着食源性致病菌检测从“单一、滞后”向“多重、即时”时代的跨越。随着全球食品安全标准的日益严格，这类兼具高效性与经济性的分子检测技术，将成为食品生产、加工、监管各环节的“标配”工具，为消费者餐桌筑起更坚实的安全防线。正如研究团队所言，该技术不仅是实验室的创新成果，更是“推动全球食品供应链微生物风险管理的重要一步”。

参考文献：Ajay G, Vishnuraj M R, Kumar N A, et al. A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products[J]. Food Chemistry, 2025, 474: 143245.

来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。