中国工程院食品安全院士团队

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细胞增殖与毒性检测（CCK8 法）

一、实验目的：通过检测细胞活力来验证目的基因对细胞增殖的影响，或验证某种药物对细胞的毒性。

二、实验原理：Cell Counting Kit-8(简称 CCK8) 试剂中含有 WST-8。活细胞特别是增殖期细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能够使 WST-8 还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，用酶标仪在 450nm 波长处测定其吸收值，即可间接反映细胞增殖情况。

三、细胞增殖与毒性检测（CCK8 法）实验步骤

1. 将细胞以 104-105 个细胞/孔的密度接种在  96 孔板 中，加入 100μL 培养基，含或不含待测化合物。在 CO2 培养箱中在 37℃ 下培养细胞 24 小时。

2. 向板中加入 10μL 不同浓度的待测物质。

3. 在培养箱中将培养板培养适当时间（如 6、12、24 或 48 小时）。

4. 向板的每个孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要将气泡引入孔中。

5. 将平板在培养箱中孵育 1-4 小时。

6. 在读板之前，在定轨振荡器上轻轻混匀。

7. 使用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。

四、常见问题及解答

Q1：做细胞活性检测时，每孔应该接种多少个细胞？
A：当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞一般最小接种量为 1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 (100 μL 培养基)，当然，也有部分极其灵敏的试剂盒或可检测更少量的细胞。

Q2：若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验，CCK 试剂使用量怎么样呢？
A：如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK8 溶液。

Q3：培养基的本底颜色如酚红会不会影响细胞活性的检测呢？
A：不会的，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不会对检测造成影响。

Q4：只可以在 450nm 波长处测 OD 值吗？
A：可以在 450nm 波长处测 OD 值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度最高。

Q5：若是暂不检测 OD 值，该如何处理？
A：若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

Q6：在实验中 OD 值太高，怎么解决？
A：CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。

Q7：应该每次做标准曲线吗？
A：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。

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细胞周期检测（PI 法）

一、实验目的：通过检测细胞内 DNA 含量的变化，检测外界干预手段对细胞生长周期的影响。

二、实验原理：

细胞周期（cell cycle）：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期组成。G0/G1 期：二倍体细胞的 DNA 含量 (2N)。S 期：DNA 开始合成，这时细胞核内 DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之间。G2/M 期：DNA 复制结束成为 4 倍体（4N)。

碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 双链螺旋的碱基之间，产生红色荧光，并且荧光强度和所嵌入的核酸含量成正比。细胞周期检测时，首先用 RNA 酶将 RNA 消化排除影响，通过流式细胞术检测 PI 荧光强度直接反映细胞各时相的 DNA 分布状态，从而计算出各时相的百分率。

三、细胞周期检测（PI 法）实验步骤

1. 细胞样品的准备：待各实验组细胞融合度达到 70%，用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入含有血清的完全培养基终止消化，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000 g 左右离心 3 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬细胞，并转移到 1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

对于悬浮细胞：收集细胞到离心管内，1000 g 左右离心 3 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬细胞，并转移到 1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2. 细胞固定：加入 1 毫升冰浴预冷 70% 乙醇，轻轻吹打混匀，4℃ 固定过夜。1000 g 左右离心 3 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

3. 碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液，现配现用：

1. 染色：每管细胞样品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃ 避光温浴 30 分钟。

2. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长 488nm 波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射分析。

四、常见问题及解答

Q1：是否可以直接用乙醇固定细胞?
A：不可以，直接 70～75% 乙醇加入很容易导致细胞聚团现象，很难重悬成单细胞，影响固定效果，其至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是: 待细胞, 充分分散成单细胞后，缓慢地滴入无水乙醇中，使其终浓度为 70～75%7 醇。

Q2：细胞量过少，无法获得数据结果?
A：首先，要保证收集足够的细胞样品 (个人经验至少收集 100 万左右): 如果药物处理后。细胞死亡过多，应该降低药物浓度；其次，固定细胞时先用预冷的 PBS 重悬细胞，再逐滴滴入无水乙醇中；细胞清洗时，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片。最后，尽量采用尖底的离心管和水平的离心机，离心后尽量用移液枪吸走上清，不要倾倒，残留一点，不要吸完。

Q3：什么样的数据结果可以用?
A：G2/M 期细胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍，在直方图上形成一个 2 倍于 G1 信号峰的高斯峰；CV(变异系数) 表示峰的宽度，CV 值越小，峰形越好，最好是在 5% 左右，一般小于 10%
也被认可。RCS 最好是在 1～3，高于 5 则不被认可。RCS 高，说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大，可能由于处理细胞的时候 RNA 酶消化不好，或者是 PI 的浓度不佳造成的。

Q4：如何提高分辨率和精确度?
A：变异系数 (Coefficient of Variation，CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精确度。而样品 CV 值为样品固有，与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA 酶消化越充分，可以减少样本的 CV 值，提高 G0/G1 峰分辨率和精确度。

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细胞凋亡检测（Annexin V-FITC 双染法）

一、实验目的：通过检测处于凋亡状态的细胞数量来检验目的基因与细胞凋亡的关联或者药物对细胞凋亡的影响。

二、实验原理：

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ能与 PS 高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了 FITC 的 AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合 Annexin V-FITC。

Annexin V-FITC 通常与细胞膜非渗透性核酸荧光染料联合使用以检测凋亡细胞。常用的染料是 PI。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。

将 AnnexinⅤ与 PI 匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与 Annexin V-FITC 和 PI 结合显色，而 PI 则被排除在活细胞 (FITC 阴性) 和早期凋亡细胞 (FITC 阳性) 之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性。

五、细胞凋亡检测（Annexin V-FITC 双染法）实验步骤

1. 待各实验组 6 孔板细胞生长至覆盖率约为 70% 时，收集上清，胰酶消化贴壁细胞，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一 5 mL 离心管中，每组设三个复孔 (为保证上机细胞数足够，细胞数目 ≥ 5×10⁵/处理）。若为悬浮细胞，直接收集。

2.1000 g 离心 5 分钟，弃上清，用 PBS 轻轻重悬细胞；

3.1000 g 离心 5 分钟，弃上清，加入 195μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。

4. 加入 5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。

5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，轻轻混匀。

6. 使用铝箔进行避光，室温 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分钟，孵育过程中重悬细胞 2-3 次，随后置于冰浴中。

7. 立即上机检测

四、常见问题及解答

Q1：构建了慢病毒转染的稳转株（带绿色荧光），检测凋亡使用 FITC 也是绿色荧光，是否会干扰？
A：会有干扰，可以换红色荧光标签的试剂进行检测。

Q2：镜下观察有很多漂浮细胞，可以看到凋亡，为什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：将漂浮的细胞收集起来再进行实验

Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦显微镜下分别选择的测量波长是多少？
A：绿色荧光可以使用 488nm 激发，PI 是红色荧光，使用 535nm 激发

Q4：FITC 和 PI 孵育时间过短，对结果有什么影响？
A：孵育时间过短，影响装载效果，时间过长，也要考虑细胞本身的状态。

Q5：想问一下用流氏检测应该怎么设门？
A：用阴性未染色的细胞调电压，门设置，annexin V-FITC 单染、PI 单染来调补偿。

来源：" Super Lab"公众号 小编：red red sea
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