研究生必备技能：细胞培养技巧（详解）
发布时间：2023-02-22 浏览次数：291
来源：科研小白的进阶之路
“ 可能你已经是实验室老江湖了，但谁不希望自己细胞养的好看一些呢？本文适用于已经进入实验室的小伙伴，没有原理，都是干货～ 建议认真阅读！”
01 — 基础操作
1. 适合惯用右手的超净台试剂布局
2. 对于新细胞心需要观察摸索最适的消化温度和时间，细胞间隙明显，大片脱落可移动即可终止消化。有些细胞消化后不会变圆形，半沙状即可；
3. 消化后需要轻轻拍打细胞壁面，震落细胞；
4. 离心速度不宜过大，1000rpm/min比较适宜
5. 离心后2 mL重旋，呈云雾状散开即可，吹散次数过多影响细胞活力，建议熟练操作；
6. 种板需一步完成，不可补加；
7. 长时间培养实验，最外圈应空出来，加入PBS或空白/阴性对照，以防培养基蒸发引起的边缘效应；
8. 把从液氮或-70℃水箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅中进行解冻。
9. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜（DMSO）浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少其对细胞的损伤。如果冻存液的浓度是10％ DMSO，那么加10 ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。但培养基越少细胞越容易贴附。
10. 血清为混合物，不同品牌/批次存在差异，不同细胞适用血清品质存在差异，应做好细胞试用筛选工作，再囤积足够量；胎牛血清在-20℃保存可达5年。
11. 血清灭活处理：4℃溶解，置于56℃ 30 mins.如果血清灭活后有纤维蛋白析出，属正常现象；
12. 使用抗生素前，查询细胞相关培养特性，根据污染类型的鉴别，有针对性的处理；
13. -80℃冻存效果有限，根据研究需求，合理冻存，半年以上实验建议液氮冻存一批；
14. 根据不同的细胞类型选择冻存的细胞密度。必要的实验进行细胞最佳冻存密度测试。
典型的细胞冻存密度：1-10 ✕ 10^6 Cells/mL；
细胞长期高密度生长（长到90%-100%），更容易老化。且对数期细胞增殖速度快，容易聚团漂浮。应更具研究需要和细胞生长特性优化传代密度。
15. 细胞一旦分化/老化，很难逆转，无法通过外界营养体系和生长条件的改变“起死回生”。
16. 小心取用无菌实验物品，勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
17. 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
18. 离心管、冻存管等容器需用抗酒精的标记笔标示内容物名称、操作日期、操作人员姓名。若是细胞传代培养，更需注明目前的代数，以及这是同一代中的第几盘。
19. 常用的生物安全柜应定期用75%酒精对内部工作区域表面、侧壁、后壁、窗户进行表面净化；二氧化碳培养箱用75%酒精喷洒消毒后擦干（每月一次）；增湿盘换水（2周1次），蒸馏水漂洗后无纺布或纸擦干，用75%酒精喷洒消毒后擦干，可按比例添加Aquaguard-2支原体预防试剂（最好预热至37℃）。显微镜、离心机也应定期擦拭。
20. 在开始养细胞并传代时，也要特别注意冻存细胞，以保持细胞有种子库存在，可以有效避免细胞损伤。
21. 胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差，做流式时的CD Marker也可能会下降。胰酶进行分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时液体体积会膨胀，多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。胰酶消化效果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度有关。
02 — 常见问题解答
1. 细胞铺板后状态不好：可通过更换其他批次细胞系，优化胰酶消化条件，血清中和量和时间改善；
2. 细胞铺板不匀：消化过度容易造成细胞整片粘连，结团率高，很难通过吹打分散；不同细胞接种前，最好进行梯度吹打实验；加样从孔的左边靠底部缓慢加入；
3. 每孔之间细胞量不同：铺板速度尽量要快；每接几个孔细胞悬液需要混匀一下；加完半边板后，需要再次讲培养皿内剩余细胞悬液充分混匀后铺板。
4. 血清溶解后有絮状物：冷冻血清应置于4℃冰箱溶解，期间需均匀摇晃，溶解后按需分装冻存，避免反复冻融，不宜在4℃长期储存。血清的颜色依据血红蛋白含量不同而变化。
5. 细胞污染排查：培养试剂和辅助试剂等条件不变，重新复苏一株细胞，复苏时注意水浴不能没过冻存管瓶盖，传代时不能触碰吸管尖头部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭无菌操作台面。观察细胞是否有污染现象。
血清污染排查：其他试剂不变，仅更换血清。
基础培养基：其他试剂保持不变，仅更换基础培养基。
PBS：其他试剂保持不变，仅更换PBS。
胰酶：若细胞复苏的很好，一传代就污染，可以尝试其他试剂保持不变，仅更换消化用胰酶，看细胞状态。
耗材：培养基及辅助试剂等条件不变，使用新耗材（培养皿或培养瓶、枪头）培养细胞，观察细胞是否有污染。
6. 细胞不贴壁：胰酶消化时间不当。时间短，易成团；胰酶处理太久，易造成细胞膜蛋白损伤，严重导致细胞死亡。
缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，无血清培养基，细胞贴壁效果下降很多。
其他原因：支原体或细菌污染；细胞状态不好，细胞老化；接种细胞数目少；复苏时处理速度太慢；培养液配制储存不当（eg:pH过碱，Gln太少）。
解决方法：
贴壁变差：可适当加高血清比例（最高不超过20%）；建议试好一个血清批次多囤一些，可以避免血清批间差对细胞的影响。
7. 细胞老化怎么办？
防止细胞老化最主要还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种，特别是传代，不能等细胞太密了之后传，一般细胞建议长到70％融合度传代最好；
换培养液应该根据自己细胞消耗培养基的情况来确定是否该换。如果感觉时间不好把握的话就多培养几瓶细胞，在不同的时间换液，最后再来比较下，看什么时候换液好，得出自己的结论；
选择正确的血清与培养基：细胞对血清特别敏感，直接影响细胞的生长。一定要选择适合的血清不然就会因营养物质不协调而导致细胞老化；
在间充质干细胞培养时必然要进行消化，但是消化对细胞的表面蛋白质有很强的破坏作用，因此不能长时间进行消化并且在选择消化酶时也要选择较为合适的pH和浓度，不然就会使细胞老化或者分化；
8. 293细胞感染病毒后凋亡严重：
通过更换血清批次，再进行转染实验并观察转染后的效果，比较分析出原因。
293传代：鉴于该细胞贴壁疏松，普通0.25%胰酶消化时间控制15s-30s；吹打动作轻柔，控制在10-20次；细胞融合率达到80%传代即可传代，不可长的太满。
9. 血清浑浊怎么办？
血清产品中出现沉淀属于常见现象，无需过多担心，并且不会影响血清的品质，对细胞培养而言也是没有任何问题的，可放心使用。若想去除沉淀，我们建议您采用2000 rpm 离心5分钟，或用0.45 μm的过滤器去除沉淀。
03 — 新手注意事项
1. 水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。
2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4. 一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
5. 判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率。
定期检查培养细胞的形态（即形状和外观）
① 细胞形态变化的迹象：细胞核旁颗粒的堆积、细胞质中有空泡、细胞团缩并从平板上脱离、外形变化
② 细胞形态变化原因：培养基改变、细胞污染、细胞老化、有毒物质
PH值降升高：
完全培养基尽量现配现用，2~8℃下避光保存一周内使用完；避免操作时间过长。操作时间快速、减少同时进行的实验数量。
PH值降低：
① 及时传代、提高传代比例或降低血清量；
② 适当松开瓶盖；
③ 增加培养液中NaHCO3浓度或减少培养箱内CO2浓度（NaHCO3含量在2.0 g/L到3.7 g/L之间时，对应的CO2浓度为5~10%）；
④若是微生物污染造成的，需及时丢弃培养基，并对操作、培养空间进行消毒处理。
引用：[1] 本文内容来自于逍鹏生物，逍鹏生物对外泌体和细胞3D培养有相关经验分享。
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